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Jul 15, 2023

Influencia de la decocción de Huangqin en la función inmune y el microbioma fecal de pollitos después de una infección experimental con Escherichia coli O78

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 16632 (2022) Cite este artículo 991 accesos 2 citas 2 detalles de métricas altmétricas Se publicó una corrección del autor de este artículo el 18 de noviembre de 2022

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La decocción de Huangqin (HQD), una fórmula de la medicina tradicional china del Shang Han Lun escrita por Zhang Zhongjing, se ha utilizado en China durante casi dos mil años. Según la medicina tradicional china y la literatura anterior, HQD tiene el efecto de eliminar el calor, eliminar toxinas, aliviar la diarrea y el dolor. Por lo tanto, el HQD se utilizó para prevenir o curar muchas enfermedades, como inflamación, diarrea, malaria y otras enfermedades gastrointestinales agudas o crónicas. El efecto de HQD, tratamientos con HQD sin una hierba y enrofloxacina (ENR) sobre la ganancia diaria promedio (ADG), las tasas de mortalidad, el índice visceral y los receptores tipo peaje (TLR), los factores inflamatorios y la microflora intestinal en E. coli O78 -Se investigaron los polluelos inoculados. La suplementación con HQD aumentó la GMD y redujo las tasas de mortalidad causadas por la exposición a E. coli, disminuyó el índice del corazón, el hígado, la bolsa de Fabricio (BF) y el bazo. La suplementación con HQD disminuyó el nivel de lisozima sérica (LZM), IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-6, reguló negativamente la expresión de ARNm de TLR4, -5 y -15 en el bazo de pollitos desafiados con E. coli. y reguló positivamente la expresión de ARNm de TLR4, -5 y -15 en BF. A nivel de filo, la suplementación con HQD revirtió el aumento de unidades taxonómicas operativas (OTU), disminuyó la abundancia relativa de bacterias dañinas Proteobacteria y aumentó la abundancia relativa de bacterias probióticas Bacteroidetes y Firmicutes. A nivel de género, HQD disminuyó la abundancia relativa de bacterias dañinas Escherichia-Shigella y Pseudomonas. Significa que el tratamiento con HQD revirtió el cambio de la estructura de la microbiota intestinal. En comparación con HQD, HQD-DZ y HQD-HQ aumentaron las tasas de mortalidad. HQD-HQ disminuyó la GMD y el índice hepático. HQD-GC disminuyó el índice del bazo. Todas las hierbas ausentes aumentaron la IL-6 sérica, pero solo HQD-HQ y HQD-SY aumentaron el TNF-α sérico. Todas las hierbas ausentes no activaron las vías de señalización de los TLR en el bazo y el BF de los polluelos. Las bacterias dañinas Escherichia-Shigella aumentaron en los tratamientos HQD-HQ y HQD-DZ. El tratamiento con HQD-DZ también aumentó el nivel de proteobacterias. Los resultados mostraron que la suplementación dietética con HQD, al regular negativamente la expresión de ARNm de TLR4, -5 y -15 en el bazo, disminuye aún más los niveles séricos de LZM e IL-1β, TNF-α, IL-10 e IL-6. , mejora la función inmune y revierte el cambio del microbioma fecal en pollitos expuestos a E. coli. En la suplementación sin hierbas, los resultados mostraron que SY y DZ desempeñan un papel clave en la reducción de los niveles de factores inflamatorios y en el mantenimiento del equilibrio del microbioma fecal, respectivamente. Más importante aún, HQ es indispensable en HQD, no solo juega un papel clave en la reducción del nivel de factores inflamatorios, sino también en el mantenimiento del equilibrio de la microflora fecal.

La E. coli patógena aviar (APEC), una bacteria gramnegativa, es un agente causal asociado con la septicemia. La colibacilosis se refiere a cualquier infección localizada o sistémica causada por APEC de serotipos específicos o por E. coli oportunistamente patógena, que causa una de las enfermedades bacterianas cruciales de las aves de corral1. Generalmente, los APEC colonizan e invaden células epiteliales y se asocian principalmente con enfermedades extraintestinales, principalmente infecciones respiratorias o sistémicas y sepsis2. La infección por E. coli en pollitos provocó diarrea grave, disminución del consumo de alimento y reducción del rendimiento del crecimiento3. Los polluelos, cuyo sistema inmunológico protector no está completamente desarrollado, son más vulnerables. Un número limitado de serotipos, principalmente E. coli O1, -O2, -O78, -O8 y -O35, están comúnmente implicados en la colibacilosis aviar4. Aunque normalmente se utilizan varios antibióticos para prevenir y controlar la colibacilosis, informes acumulativos han demostrado que la resistencia a los medicamentos de E. coli O78 ha aumentado debido a la propagación de genes de resistencia como las betalactamasas de espectro extendido (ESBL) y/o Amp mediado por plásmidos. -C beta-lactamasas (Amp-C)5. Por lo tanto, se necesitan con urgencia posibles alternativas a los antibióticos para reducir el uso de fármacos antimicrobianos en la producción avícola.

HQD, una fórmula de la medicina tradicional china del Shang Han Lun escrita por Zhang Zhongjing, consta de cuatro componentes: escutelaria china (Scutellaria baicalensis), raíz de peonía blanca (Paeoniae radix alba), azufaifa (Ziziphus jujuba) y regaliz (Glycyrrhiza glabra). . Los estudios clínicos han demostrado que HQD es seguro y eficaz para el tratamiento de síntomas gastrointestinales complejos, como la colitis ulcerosa y el cáncer asociado6. Los investigadores sugieren que esto se debe a que el HQD podría regular la estructura de la flora intestinal e inhibir la vía de señalización inflamatoria intestinal7. Los principales efectores de HQD son baicalina, paeoniflorina, polisacáridos y flavonoides, que pueden regular la cantidad de mastocitos y regular negativamente la expresión de factores inflamatorios mediante la activación de TLR4/MyD88/NF-κB, IL-6/JAK/STAT3. y las vías de señalización STAT3/NF-κB/IL-68, desempeñan así un papel importante en la regulación inmune y tienen un efecto antiinflamatorio9. HQD no tiene efecto inhibidor sobre E. coli in vitro, pero el efecto antibacteriano aumentó después del metabolismo de la flora intestinal10, lo que indica que el efecto bacteriostático de HQD depende principalmente de la regulación de los metabolitos y el equilibrio de las bacterias intestinales, en lugar de un efecto directo sobre las bacterias patógenas. Por lo tanto, este estudio planteó la hipótesis de que el HQD es eficaz para el tratamiento de la colibacilosis de los pollitos al regular la función inmune y la estructura de la microflora intestinal.

Para investigar los mecanismos moleculares del tratamiento con HQD in vivo, los polluelos fueron inoculados experimentalmente con E. coli. Se midieron los niveles de expresión de LZM, citoquinas inflamatorias en suero y TLR en bazo y BF. Además, se perfiló la microbiota intestinal mediante la secuenciación Illumina MiSeq 2500 de la región V3-V4 del gen bacteriano 16S rDNA.

En comparación con el CG, los pollitos expuestos a E. coli a los 27 días de edad mostraron plumas erizadas, ojos cerrados, renuencia a moverse y defecaron heces blancas o verdes con respiraderos sucios. El examen post mortem mostró que la infección por E. coli provocó perihepatitis grave, pericarditis y manchas sangrantes en el intestino delgado (Fig. 1).

Los polluelos con colibacilosis muestran sitio de sangrado intestinal severo (A), perihepatitis (B) y pericarditis (C).

En MG, las tasas de mortalidad aumentaron significativamente (p < 0,05), en comparación con el GC. En comparación con el MG, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente (p < 0,05) en los gránulos HQD de 250 y 500 mg/kg·BW, los gránulos HQD-GC de 500 mg/kg·BW y los gránulos HQD-SY de 500 mg/kg·BW. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los gránulos de HQD-GC de 500 mg/kg·BW y 250 mg/kg·BW, en los gránulos de HQD-SY de 500 mg/kg·BW y 250 mg/kg·BW. Por lo tanto, la dosis de los grupos de 250 mg/kg·BW no se analizó, mientras que la dosis de los grupos de 500 mg/kg·BW mereció más estudio (Fig. 2).

La mortalidad de los polluelos estuvo representada en (A – C). El superíndice de letra diferente en la misma columna indica que la diferencia es significativa (p < 0,05). GC, grupo control; MG, grupo modelo; DZ, azufaifa, Ziziphus jujuba; HQ, casquete chino, Scutellaria baicalensis; GC, regaliz, Glycyrrhiza glabra; SY, raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba; HQD, la decocción consta de DZ, HQ, GC y SY; HQD-DZ, HQD sin DZ; HQD-GC, HQD ausente de GC; HQD-SY, HQD ausente de SY; HQD-HQ, HQD ausente de HQ; ENR, 10 mg/kg de enrofloxacina.

En MG, la GMD entre 1 y 32 días de edad disminuyó significativamente (p < 0,05), en comparación con el GC. En comparación con el MG, la GMD entre 1 y 32 días de edad aumentó significativamente (p < 0,05) en el tratamiento con HQD. No hubo diferencias significativas entre la suplementación con HQD-HQ, HQD-DZ, HQD-GC, HQD-SY y ENR en comparación con HQD (Fig. 3).

La ganancia diaria promedio de los polluelos se representó en (A – C). El superíndice de letra diferente en la misma columna indica que la diferencia es significativa (p < 0,05). GC, grupo control; MG, grupo modelo; DZ, azufaifa, Ziziphus jujuba; HQ, casquete chino, Scutellaria baicalensis; GC, regaliz, Glycyrrhiza glabra; SY, raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba; HQD, la decocción consta de DZ, HQ, GC y SY; HQD-DZ, HQD sin DZ; HQD-GC, HQD ausente de GC; HQD-SY, HQD ausente de SY; HQD-HQ, HQD ausente de HQ; ENR, 10 mg/kg de enrofloxacina.

En comparación con CG, el índice cardíaco y el índice hepático aumentaron (p <0,05) en MG, lo que se revirtió con los tratamientos HQD y ENR. Sin embargo, en comparación con el CG, el índice BF disminuyó significativamente (p <0,05) en MG, lo que se revirtió con la suplementación de los tratamientos HQD y ENR. Los pollitos en MG no mostraron ningún efecto sobre el índice del bazo, mientras que el mismo índice aumentó con la suplementación con HQD. HQD-DZ y HQD-SY tienen el mismo efecto que HQD, HQD-GC resultó en una disminución del índice del bazo, mientras que HQD-HQ resultó en un aumento del índice hepático en pollitos expuestos a E. coli (Tabla 1).

En comparación con CG, el nivel de LZM en el suero de los pollitos expuestos a E. coli aumentó, lo que se revirtió significativamente con la administración de HQD y ENR. HQD-GC y HQD-SY tienen el mismo efecto que HQD, pero los tratamientos HQD-DZ y HQD-HQ no pudieron revertir el aumento en el nivel de proteína LZM (Fig. 4).

En la figura se muestra el nivel de lisozima de los pollitos. Los datos se expresan como media ± SEM. Significación estadística: *p < 0,05 frente al grupo modelo, #p < 0,05 frente al grupo HQD. GC, grupo control; MG, grupo modelo; DZ, azufaifa, Ziziphus jujuba; HQ, casquete chino, Scutellaria baicalensis; GC, regaliz, Glycyrrhiza glabra; SY, raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba; HQD, la decocción consta de DZ, HQ, GC y SY; HQD-DZ, HQD ausente de DZ; HQD-GC, HQD ausente de GC; HQD-SY, HQD ausente de SY; HQD-HQ, HQD ausente de HQ; ENR, grupo enrofloxacino. (La dosis de la medicina china era de 500 mg/kg).

Se realizó ELISA para determinar el nivel de proteína de citocinas inflamatorias en el suero. En MG, los niveles de proteína de IL-1β, TNF-α e IL-10 en el suero fueron significativamente mayores (p < 0,05), en comparación con el GC. En comparación con MG, los niveles de proteína de IL-1β, TNF-α e IL-10 en el suero aumentaron significativamente (p <0,05) en el tratamiento con HQD; sin embargo, no hubo diferencias significativas en comparación con CG. Los tratamientos HQD y ENR tuvieron el mismo efecto. El nivel de proteína de IL-6 aumentó con la exposición a E. coli en el suero de los pollitos, en comparación con el CG. Sin embargo, el tratamiento con HQD redujo significativamente (p <0,05) el nivel de proteína por debajo del nivel del grupo de control. En comparación con el grupo HQD, el nivel de proteína de IL-6 aumentó significativamente (p <0,05) en los tratamientos HQD-HQ, HQD-SY, HQD-DZ y HQD-GC, mientras que el de IL-1β e IL-10 no mostrar alguna diferencia significativa. El nivel de proteína TNF-α aumentó significativamente (p <0,05) en los tratamientos HQD-SY y HQD-HQ, en comparación con el grupo HQD. Además, el nivel de proteína TNF-α en los tratamientos HQD-SY y HQD-HQ fue significativamente mayor (Tabla 2).

Para explorar más a fondo el efecto de HQD sobre la función inmune de los pollitos expuestos a E. coli, se detectaron los niveles de ARNm de TLR4, -5 y -15 en el bazo y BF. En MG, los niveles de ARNm de TLR4, -5 y -15 fueron significativamente mayores (p < 0,05) en el bazo, sin embargo, no hubo diferencias significativas en BF, en comparación con CG. Los tratamientos con HQD y sin hierbas de los niveles de ARNm de TLR4, -5 y -15 fueron significativamente mayores (p <0,05) en BF, sin embargo, no hubo diferencias significativas en el bazo, en comparación con CG. En comparación con HQD, el tratamiento con ENR de los niveles de ARNm de TLR4, -5 y -15 no hubo diferencias significativas en el bazo y BF, y no hubo diferencias significativas entre los tratamientos sin hierba y HQD (Tabla 3).

En comparación con CG, la diversidad alfa se redujo significativamente (p <0,05) en MG, lo que se revirtió con el tratamiento con HQD. No hubo diferencias significativas en los tratamientos CG y HQD. El índice Chao1 se redujo significativamente (p <0,05) en los tratamientos HQD-HQ, HQD-DZ y HQD-SY, en comparación con el grupo HQD. Además, el índice de Shannon del tratamiento con HQD-DZ disminuyó significativamente (p <0,05) en comparación con el grupo HQD. El índice Chao1 y el índice de Shannon se redujeron significativamente (p <0,05) en el tratamiento ENR, en comparación con CG (Tabla 4).

Una curva de rarefacción meseta de OTU indicó que la profundidad de secuenciación cubría todas las especies en las muestras. La inoculación de E. coli aumentó las OTU, en comparación con CG, que se revirtieron con la administración de HQD y ENR. El análisis de coordenadas principales (PCoA) mostró similitud entre muestras, con similitud indicada por la distancia en los diagramas. La inoculación de E. coli alteró la composición y estructura de la microbiota intestinal según la PCoA. El tratamiento con HQD inhibió parcialmente los cambios inducidos por E. coli en la microbiota intestinal (Fig. 5).

En la figura se muestran los análisis de los microorganismos intestinales de los pollitos. GC, grupo control; MG, grupo modelo; DZ, azufaifa, Ziziphus jujuba; HQ, casquete chino, Scutellaria baicalensis; GC, regaliz, Glycyrrhiza glabra; SY, raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba; HQD, la decocción consta de DZ, HQ, GC y SY; HQD-DZ, HQD sin DZ; HQD-GC, HQD ausente de GC; HQD-SY, HQD ausente de SY; HQD-HQ, HQD ausente de HQ; ENR, grupo enrofloxacino. (La dosis de la medicina china era de 500 mg/kg).

La estructura de la comunidad de microbiota intestinal se informó mediante histogramas a nivel de filo y género. Todas las muestras contenían abundantes Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria. En MG, la abundancia relativa de Bacteroidetes y Firmicutes disminuyó significativamente (p < 0,05) y aumentó (p < 0,05) la proporción de Proteobacteria, en comparación con CG. Estas alteraciones se revirtieron significativamente con la administración de HQD. En comparación con el grupo HQD, el HQD-DZ aumentó significativamente (p <0,05) en la abundancia de Proteobacteria. El tratamiento ENR no pudo recuperar los cambios en la abundancia de bacterias dominantes en comparación con MG. Por el contrario, la abundancia de Proteobacteria aumentó aún más (Fig. 6).

En la figura se muestra el análisis a nivel de filo de la abundancia relativa de microorganismos intestinales de los polluelos. GC, grupo control; MG, grupo modelo; DZ, azufaifa, Ziziphus jujuba; HQ, casquete chino, Scutellaria baicalensis; GC, regaliz, Glycyrrhiza glabra; SY, raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba; HQD, la decocción consta de DZ, HQ, GC y SY; HQD-DZ, HQD ausente de DZ; HQD-GC, HQD ausente de GC; HQD-SY, HQD ausente de SY; HQD-HQ, HQD ausente de HQ; ENR, grupo enrofloxacino. (cada color representa un filo bacteriano). (La dosis de la medicina china era de 500 mg/kg).

En todas las muestras se identificaron más de 30 géneros. Bacteroides, Faecalibacterium, Lactobacillus y Prevotella fueron comunidades dominantes en el grupo de control, pero se redujeron con la inoculación de E. coli. En comparación con CG, Escherichia-Shigella se convierte en el género dominante, pero se redujo con el tratamiento HQD. La estructura de la comunidad de microbiota intestinal de HQD, HQD-GC y HQD-SY era similar a la de CG. En comparación con el grupo HQD, la proporción de Escherichia-Shigella aumentó significativamente en los tratamientos HQD-DZ y HQD-HQ (Fig. 7).

En la figura se muestra el análisis a nivel de género de la abundancia relativa de microorganismos intestinales de los polluelos. GC, grupo control; MG, grupo modelo; DZ, azufaifa, Ziziphus jujuba; HQ, casquete chino, Scutellaria baicalensis; GC, regaliz, Glycyrrhiza glabra; SY, raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba; HQD, la decocción consta de DZ, HQ, GC y SY; HQD-DZ, HQD sin DZ; HQD-GC, HQD ausente de GC; HQD-SY, HQD ausente de SY; HQD-HQ, HQD ausente de HQ; ENR, grupo enrofloxacino. (cada color representa un género bacteriano). (La dosis de la medicina china era de 500 mg/kg).

Teniendo en cuenta la incidencia de APEC multirresistente y su riesgo potencial para la salud humana y animal, es imperativo desarrollar estrategias alternativas para reducir el efecto nocivo inducido por la infección por E. coli11,12. Estudios anteriores han demostrado que HQD no tiene ningún efecto inhibidor sobre E. coli in vitro, pero este efecto se ha encontrado en estudios in vivo13. Por lo tanto, se especula que el efecto positivo de HQD en la inoculación de E. coli en pollitos depende del metabolismo intestinal, la regulación de la estructura de la microflora intestinal y su función inmune.

En un estudio anterior, se utilizó el método de inyección intramuscular para inocular a los pollitos, lo que permitió a E. coli cruzar la primera barrera inmunitaria y entrar al torrente sanguíneo, para luego iniciar la secreción de factores inflamatorios por parte de las células epiteliales y los macrófagos14. Los genes de citoquinas IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 son los reguladores de las respuestas inmunes pro y antiinflamatorias. NF-κB desempeña un papel importante como factor de transcripción en las respuestas inflamatorias e inmunes en muchas enfermedades inflamatorias, y participa en la transcripción de una variedad de proteínas, incluidas RelA (P65), RelB, P50 y P5215 de mamíferos,16. En el presente estudio, la inoculación de E. coli provocó perihepatitis y pericarditis graves, y un aumento de las tasas de mortalidad, una disminución de la GMD y un aumento de los índices de órganos del corazón y el hígado en los pollitos inoculados, lo que se atenuó con la administración de HQD. Además, la infección experimental resultó en un aumento de LZM, así como en niveles mejorados de factores inflamatorios, incluidos IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 en suero, lo que indica la activación de la respuesta inflamatoria después de la inoculación de E. coli. Mientras que, HQD disminuyó el nivel sérico de LZM, IL-1ß, TNF-α, IL-10, IL-6 para mejorar en consecuencia la función inmune. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los tratamientos HQD-SY, HQD-DZ y HQD-HQ en comparación con HQD, lo que indica que SY, DZ y HQ desempeñan un papel clave en la reducción del nivel de factores inflamatorios.

Vale la pena señalar que la inoculación de E. coli provocó un aumento del nivel de IL-10, que tiene un efecto antiinflamatorio e inmunosupresor. Algunos investigadores creen que la citoquina antiinflamatoria IL-10 puede reducir la intensidad de la respuesta inflamatoria en infecciones graves. Por otro lado, la inhibición de la capacidad de defensa del organismo conduce a la persistencia de la infección microbiana17. Por tanto, se cree que el aumento de IL-10 en una infección puede ser una manifestación de lesión grave del organismo18. En el presente estudio, la inoculación de E. coli aumentó el nivel de proteína IL-10, lo que puede indicar que E. coli causa un daño grave al cuerpo.

Los TLR expresados ​​por células del sistema inmunológico de mamíferos y aves tienen la capacidad de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos. La activación de la vía de señalización de los TLR juega un papel importante en la defensa contra patógenos invasores. Los TLR podrían identificar los patrones moleculares relacionados con los microbios, activar la vía de señalización dependiente de MyD88, activar el factor de transcripción NF-kB que produce IL-1ß, IL-6, TNF-α y otras citoquinas, y mejorar la función inmune del cuerpo19,20,21 . En los pollitos, los TLR1A, -1B, -2A, -2B, -3, -4, -5, -7, -15 y -21 se expresan mediante células del sistema inmunológico y también mediante células epiteliales. El reconocimiento de ligandos por los TLR mejora la producción de citoquinas y aumenta la expresión de moléculas coestimuladoras que modulan las respuestas inmunes adaptativas para exhibir propiedades proinflamatorias y antiinflamatorias22,23; por ejemplo, la proteína TLR4 exhibe una respuesta inmune a nivel tisular para luchar contra los patógenos invadidos. en pollitos. Entre ellos, el bazo es el órgano inmunológico periférico más grande, y el BF y el timo son órganos linfoides centrales en el sistema inmunológico de las aves de corral.

En el presente estudio, la inoculación de E. coli condujo a niveles mejorados de ARNm de TLR4, -5 y -15 en el bazo, lo que indica la activación del sistema inmunológico innato en el bazo después de la infección. Estos TLR regulados positivamente en el bazo estuvieron acompañados por un aumento de los factores inflamatorios séricos, incluidos IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10. La expresión de TLR en el bazo de los pollitos tratados con HQD se reguló a la baja, lo que acompañó a un aumento de todos los factores inflamatorios séricos para mejorar la función inmune de los pollitos infectados. Con respecto a los niveles de ARNm de TLR en BF, no hubo diferencias significativas entre CG y MG. La expresión de TLR en BF de pollitos tratados con HQD estuvo regulada positivamente, lo que indica que HQD regula la capacidad antiinfección al aumentar los niveles de ARNm de TLR4, -5 y -15, disminuyendo aún más la LZM sérica y la IL-1β, TNF. -α, IL-10, IL-6 nivel de pollitos sufrieron infección por E. coli. En resumen, se sugiere que HQD podría regular negativamente las expresiones de TLR4, -5 y -15 en el bazo, pero regular positivamente las de TLR en BF, de modo que juntos reduzcan los niveles de factores inflamatorios. Si bien, no hubo diferencias entre la expresión de TLR de HQD y todos los tratamientos con hierba ausente tanto en el bazo como en BF, lo que indica que HQD desempeña un papel en la regulación de los TLR en su conjunto y luego en los factores inflamatorios.

Se han informado cambios estructurales en la microbiota intestinal en modelos de E. coli24. La microflora intestinal juega un papel importante en la salud general del huésped22,25, que está estrechamente relacionada con la inmunidad, el metabolismo, la digestión, la absorción y la susceptibilidad a las enfermedades del huésped26. Estudios anteriores han informado que Firmicutes puede metabolizar y producir ácido butírico en el tracto intestinal, que proporciona energía para el crecimiento y desarrollo de las células intestinales27. Además, influye en la fermentación de carbohidratos y polisacáridos para mejorar la transformación de nutrientes y energía en el organismo animal28. ENR tiene un buen efecto terapéutico, pero conduce a una desregulación de la flora intestinal, lo que está relacionado con su amplia acción bactericida. Conduce a la destrucción de un gran número de bacterias en el intestino, lo que libera más LPS, desencadenando una respuesta inflamatoria, lo que también explica el aumento del nivel de citocinas inflamatorias29. Por tanto, es de gran importancia mantener la estabilidad estructural y la diversidad de la flora intestinal. En el presente estudio, la abundancia y diversidad de la microflora intestinal en pollitos inoculados con E. coli disminuyeron significativamente (p <0,05). Es un marcador de desregulación microbiana intestinal. El tratamiento con HQD tuvo un efecto terapéutico sobre la disminución de la diversidad de bacterias causada por la inoculación de E. coli. Los tratamientos HQD-HQ, HQD-DZ, HQD-GC y HQD-SY tuvieron diversos grados de influencia en los tres niveles de filo. Estos resultados indican que cada hierba en HQD influye en la segregación estructural de la microbiota intestinal, en la que DZ juega un papel importante en el mantenimiento de la estructura de la microflora intestinal de los pollitos expuestos a E. coli. Los resultados mostraron que E. coli rompió la barrera inmune, colonizó y proliferó en las mucosas, las cuales produjeron toxinas que causaron daño a diferentes órganos siguiendo la circulación sanguínea. E. coli desafió la función inmune del cuerpo y aumentó la prevalencia de una gran cantidad de patógenos oportunistas en el intestino. Finalmente, la inoculación con E. coli disminuyó la diversidad de la microflora intestinal y alteró su equilibrio. Afortunadamente, HQD puede atenuar eficazmente este fenómeno. En comparación con el grupo HQD, el índice de Shannon en el tratamiento con HQD-DZ disminuyó significativamente, lo que indica que DZ tuvo un papel importante en el mantenimiento de la estructura de la microflora intestinal de los pollitos expuestos a E. coli.

El análisis de la estructura de la microflora intestinal a nivel de filo en cada tratamiento experimental mostró cambios significativos que incluyen un aumento en la proporción de Proteobacterias y una disminución en la proporción de Firmicutes. Las proteobacterias se consideran un marcador del desequilibrio de la microbiota intestinal, y una gran cantidad de proteobacterias en el intestino refleja un retraso en el crecimiento o una estructura de microbiota intestinal inestable30. La administración de HQD atenúa este cambio y mantiene en equilibrio la microflora intestinal. El tratamiento ENR no pudo recuperar los cambios en la abundancia de bacterias dominantes en comparación con MG. Por el contrario, la abundancia de proteobacterias aumentó aún más. Los resultados sugieren que el tratamiento con HQD es más beneficioso que ENR en el tratamiento de la infección por E. coli. El tratamiento con HQD-DZ aumentó la prevalencia de bacterias dañinas, a saber, proteobacterias, lo que indica que las DZ en HQD desempeñan un papel clave en mantener el equilibrio del microbioma fecal en el nivel del filo.

La estructura genérica de la microflora cambió mediante la inoculación de E. coli. La proporción de Proteobacteria, Faecalibacterium, Lactobacillus y Prevotella disminuyó, y Escherichia-Shigella se convirtió en el género dominante, lo que se revirtió con un tratamiento con HQD similar al del grupo de control, lo que indica que las proporciones de la mayoría de las bacterias volvieron al nivel de control después del tratamiento con HQD. Las proporciones cambiaron después del tratamiento con HQD, HQD-GC y HQD-SY, y se volvieron similares a la estructura del microbioma en CG, lo que indica que HQD, HQD-GC y HQD-SY tuvieron un efecto protector sobre los cambios estructurales causados ​​por la inoculación de E. coli. Además, HQD-DZ y HQD-HQ aumentaron la prevalencia de Escherichia-Shigella, lo que indica que DZ y HQ en HQD tuvieron un cierto efecto regulador sobre el aumento de Escherichia-Shigella y desempeñan un papel clave en mantener el equilibrio del microbioma fecal a nivel de género. .

En conclusión, la aplicación de HQD mejora la función inmune al regular negativamente la expresión de ARNm de TLR4, -5 y -15 en el bazo, disminuyendo aún más los niveles séricos de LZM e IL-1β, TNF-α, IL-10 e IL-6. y revertir el cambio del microbioma fecal en pollitos expuestos a E. coli. Además, SY y DZ desempeñan un papel clave en la reducción del nivel de factores inflamatorios y mantienen el equilibrio del microbioma fecal, respectivamente. Más importante aún, HQ es indispensable en HQD, no solo juega un papel clave en la reducción del nivel de factores inflamatorios, sino también en el mantenimiento del equilibrio de la microflora fecal.

Un total de 130 pollitos machos Isa brown de 1 día de edad fueron asignados aleatoriamente a uno de 13 grupos de tratamiento con 10 polluelos por grupo. Los pollitos en CG fueron alimentados con una dieta basal para satisfacer los requerimientos nutricionales de los pollitos durante todo el período experimental; Los pollitos del grupo MG fueron inoculados con E. coli sin suplementos alimentarios. Los pollitos inoculados con E. coli en ENR, HQD, HQD-HQ, HQD-DZ, HQD-GC y HQD-SY se suplementaron con ENR 10 mg/kg·BW, HQD gránulos 250 y 500 mg/kg·BW, HQD-HQ gránulos 250 y 500 mg/kg·BW, gránulos HQD-DZ 250 y 500 mg/kg·BW, gránulos HQD-GC 250 y 500 mg/kg·BW y gránulos HQD-SY 250 y 500 mg/kg·BW respectivamente. Los polluelos se transfirieron a cámaras de alojamiento con virutas de pino sobre un piso de concreto en un ambiente con temperatura controlada (temperatura 35 ℃, humedad 60–70%) y se alojaron en dos cámaras separadas con condiciones ambientales idénticas para separar el grupo de control de los polluelos infectados. Todos los fármacos suplementarios se administraron después de la inyección intramuscular de E. coli a los 27 días de edad y se sumaron hasta los 32 días de edad. Todos los polluelos tuvieron libre acceso a alimento y agua de bebida durante todo el período experimental. Todos los días se observaron y registraron el comportamiento, el estado de las plumas y los síntomas clínicos de los polluelos. Además, también se tomaron registros de peso corporal, consumo de alimento y mortalidad diaria. El protocolo experimental con animales para este estudio fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Agrícola de China.

Para rejuvenecer, se utilizó la cepa de E. coli O78 (número de depósito: CVCC1490; Centro de Gestión de Preservación de Cepas de Microorganismos Veterinarios de China, Beijing, China) para inocular en los polluelos que se sacrificaron después y se recolectaron sus hígados. Al rayar el hisopo de hígado, se aisló E. coli O78 en una placa de agar MacConkey a 37 °C durante 24 h y se congeló a -80 °C31. Los inóculos bacterianos se prepararon durante 24 h de crecimiento en caldo Luria-Bertani (LB) (Difco, Sparks, EE. UU.) a 37 °C. Las bacterias se recogieron y se lavaron dos veces, y los recuentos se ajustaron a 0,6 × 109 UFC/ml para obtener suficientes bacterias para la inyección intramuscular a pollitos con 0,5 ml de inóculo a los 27 días de edad32.

Según la prescripción de HQD, HQ, SY, DZ y GC se remojaron en una proporción de 3:2:2:2 durante 60 min y se hirvieron durante 40 min. Después de la filtración, el residuo de HQ se secó en una estufa de secado, luego el residuo triturado se mezcló con el filtrado concentrado en el peletizador y luego se cortó hasta obtener gránulos húmedos después de la desecación. En la preparación de gránulos de HQD-SY, HQD-DZ, HQD-GC y HQD-HQ, SY, DZ, GC y HQ estuvieron ausentes en la decocción, respectivamente.

A los 32 días de edad, se midió el peso vivo de los pollitos y luego se sacrificaron y se recolectaron hígado, corazón, bazo y LM para calcular el índice visceral de los pollitos. La fórmula para calcular el índice visceral es Índice visceral (g/kg) = peso visceral (g)/peso vivo (kg).

A los 32 días de edad, para evaluar los efectos de los fármacos sobre las sustancias inmunes innatas y las citoquinas en pollitos con colibacilosis, se extrajo sangre y se separó el suero. El nivel de LZM, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 en suero se cuantificaron utilizando kits ELISA (Wuhan Beinley Biotechnology Co., LTD, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron tres muestras de cada grupo por triplicado. Los resultados se expresaron como contenido de LZM o citoquinas por ml de suero en pollitos.

A los 32 días de edad, para evaluar el efecto de los fármacos sobre la expresión de TLR en órganos inmunes de pollitos con colibacilosis, se recogieron el BF y el bazo. El ARN total se extrajo del bazo y del BF utilizando el reactivo Trizol (TaKaRa Co., Tokio, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante. Según el kit Bio-Rad (Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd., China), se tomó 1 μL de ARN para la reacción de qPCR. El gen Gapdh se utilizó como gen de mantenimiento para normalizar los valores de CT. La secuencia completa del ARNm del gen Gapdh en NCBI se utilizó para diseñar cebadores específicos, que fueron sintetizados por Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd. Se analizaron tres muestras de cada grupo por triplicado. Las secuencias de cebadores (Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd., China) utilizadas se muestran en la Tabla 5.

A los 32 días de edad se estudió la flora intestinal de todos los grupos. Se recogieron heces de cada grupo de animales y se colocaron en un tubo de criopreservación estéril, que se congeló inmediatamente con nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para su uso. El ADN genómico total de las heces se extrajo y purificó utilizando el kit DNeasy PowerSoil (100) (Qiagen, Hilden, Alemania). La integridad y cantidad de ADN se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría. La cantidad de 500 ng de ADN purificado se extrajo de cada muestra para la posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del ADNr 16S.

Se tomaron muestras y se diluyeron a 10 ng/μL con agua estéril. Utilizando el ADN genómico diluido como plantilla, las secuencias hipervariables V3 + V4 de ADNr 16S se amplificaron mediante PCR con Takara Ex Taq (TaKaRa Co., Tokio, Japón) con cebadores universales modificados con código de barras (adelante: 343F, 5′-TACGGRAGGCAGCAG- 3'; reverso: 798R, 5′-AGGGTATCTAATCC T-3'). Las mezclas de PCR contenían 15 μL de tampón de PCR Gflex 2 ×, 2 μL de mezcla de cebador (5 pmol/μL), 5 μL de plantilla de ADN diluido (10 ng/μL), 0,6 μL de ADN polimerasa Tks Gflex (1,25 U/μL). en un volumen de reacción total de 30 μL. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 26 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y elongación a 72 °C durante 20 s, con una final paso de elongación a 72 °C durante 5 min. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 2% y el producto purificado se usó como segunda plantilla de PCR para la amplificación. Los pasos anteriores se repitieron para la purificación y luego se utilizó el kit de ensayo Qubit dsDNA (Life Technologies, CA, EE. UU.) para la detección cuantitativa. De acuerdo con la concentración de los productos de PCR, se mezclaron cantidades iguales de muestras y los amplicones V3 + V4 con código de barras fueron secuenciados por Illumina MiSeq (Illumina, EE. UU.) (Shanghai OE Biotech. Co., Ltd., China) (“Información complementaria ”).

La diversidad de especies en diferentes grupos se evaluó mediante análisis taxonómico de OTU; además, se analizó la composición de la flora a nivel de filo y género para explicar las diferencias en la estructura de la flora entre los diferentes grupos. En este estudio, se utilizaron para el análisis de diversidad el índice de abundancia de la comunidad α de microorganismos (Chao1) y el índice de diversidad de la comunidad (Shannon). Cuanto mayor sea el índice Chao1, mayor será la riqueza de flora en la muestra. Cuanto mayor es el índice de Shannon, mayor es la diversidad de la flora intestinal33.

Las secuencias sin procesar se eliminaron utilizando Trimmomatic v.0.3.6 y FLASH v.6.0. software y filtrado de acuerdo con sus códigos de barras y secuencias de cebadores con QIIME v.1.5.0. Las quimeras se identificaron y excluyeron utilizando el algoritmo UCHIME v.4.2.40. Se agruparon secuencias optimizadas de alta calidad en OTU con una identidad de secuencia del 97 % frente a un subconjunto de la base de datos de secuencias Silva 16S (versión 119 1). El análisis dependiente del taxón se llevó a cabo utilizando el clasificador bayesiano ingenuo del Ribosomal Database Project (RDP), con un límite de arranque del 80%. La diversidad alfa (índices de Shannon y Simpson), la abundancia (índices Chao1 y ACE) y la cobertura y rarefacción de bienes se analizaron con mothur v.1.31.2. Se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para visualizar las diferencias en la composición de la comunidad de la mucosa nasal. Los gráficos de PCoA se generaron en función de los índices de Bray-Curtis. Se utilizó el algoritmo del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) para identificar los taxones responsables de las diferencias entre los grupos de tratamiento y control. Los biomarcadores utilizados en el presente estudio tuvieron un umbral de tamaño del efecto de dos.

El análisis estadístico de los datos de los ensayos ELISA y qPCR se llevó a cabo mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para detectar diferencias entre los valores medios, que luego se analizaron adicionalmente para determinar su significancia con la prueba LSD. Para analizar las diferencias en mortalidad se utilizó la prueba de chi-cuadrado. En todos los casos se consideró estadísticamente significativo p < 0,05.

Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

El protocolo experimental con animales para este estudio fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Agrícola de Shanxi.

Este estudio se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24320-4

Azufaifa, Ziziphus jujuba

Casquillo chino , Scutellaria baicalensis

Regaliz, Glycyrrhiza glabra

Raíz de peonía blanca, Paeoniae radix alba

Medicina china de decocción que consta de DZ, HQ, GC y SY.

HQD ausente de DZ

HQD ausente de HQ

HQD ausente de GC

HQD ausente de SY

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Descargar referencias

Gracias al profesor Jianxin Zhang (Facultad de Ciencias Animales, Universidad Agrícola de Shanxi, Taigu, República Popular China) por proporcionar el lugar de alimentación de los polluelos.

Esta investigación fue financiada por el proyecto de investigación básica de la provincia de Shanxi [número de subvención 20210302123233]; Fondo de puesta en marcha de investigaciones científicas para médicos de la provincia de Shanxi [número de subvención 2020BKS01]; Fondo de Inicio de Investigación Científica para Doctores de la Universidad de Medicina China de Shanxi [número de subvención 20170101]; el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shanxi [número de subvención 201903D221013]; y el fondo asignado para el Sistema de Investigación de Tecnología Agroindustrial Moderna de la provincia de Shanxi [número de subvención 2022-07].

Estos autores contribuyeron igualmente: Junyan Wang, Rui Li y Minai Zhang.

Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de Shanxi, Taigu, República Popular China

Junyan Wang, Jianjian Feng, Linjie Bao, Yihe Wu y Shuming Chen

Facultad de Ingeniería Farmacéutica y Alimentaria, Universidad de Medicina China de Shanxi, Yuci, República Popular China

Junyan Wang, Rui Li, Chensheng Gu, Haili Wang y Xichun Zhang

Centro Técnico de la Aduana de Taiyuan, Taiyuan, Shanxi, República Popular China

Minai Zhang

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JW, RL: curación de datos, redacción: preparación del borrador original. MZ: orientación para la selección y diseño de este tema de investigación, especialmente en el rejuvenecimiento e inoculación de E. coli O78. YW, JF: visualización, investigación. SC, XZ: supervisión. LB, CG: software, validación. HW, JW: redacción, revisión y edición. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Shuming Chen o Xichun Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

La versión original en línea de este artículo fue revisada: La versión original de este artículo contenía un error en el orden de los nombres de los autores, que se indicaba incorrectamente como Junyan Wang, Rui Li, Minai Zhang, Chensheng Gu, Haili Wang, Jianjian Feng, Linjie Bao, Yihe Wu, Xichun Zhang y Shuming Chen.

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Reimpresiones y permisos

Wang, J., Li, R., Zhang, M. et al. Influencia de la decocción de Huangqin en la función inmune y el microbioma fecal de pollitos después de una infección experimental con Escherichia coli O78. Informe científico 12, 16632 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20709-3

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Recibido: 30 de diciembre de 2021

Aceptado: 16 de septiembre de 2022

Publicado: 05 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20709-3

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