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Jun 05, 2023

Decodificación de materiales a base de hierbas de preparaciones de MTC con el multi

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 5988 (2022) Cite este artículo 2551 Accesos 8 Citas 2 Detalles de métricas altmétricas Con el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento,

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 5988 (2022) Citar este artículo

2551 Accesos

8 citas

2 altmétrico

Detalles de métricas

Con el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, también han avanzado los enfoques para evaluar los ingredientes biológicos en las preparaciones de la Medicina Tradicional China (MTC). Utilizando un enfoque de secuenciación de múltiples códigos de barras, en teoría podrían identificarse todos los ingredientes biológicos de las preparaciones de MTC, siempre que su ADN esté presente. Los ingredientes biológicos de varias preparaciones clásicas de MTC se analizaron con éxito basándose en este enfoque en estudios previos. Sin embargo, la universalidad, sensibilidad y confiabilidad de este enfoque en un conjunto diverso de preparaciones de MTC siguen sin estar claras. En este estudio, seleccionamos cuatro preparaciones representativas de MTC, a saber, Bazhen Yimu Wan, Da Huoluo Wan, Niuhuang Jiangya Wan y You Gui Wan, para una evaluación concreta del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Basándonos en los biomarcadores ITS2 y trnL, hemos detectado con éxito los materiales herbales prescritos (PHM) en estas preparaciones representativas de la MTC (sensibilidad mínima: 77,8 %, sensibilidad máxima: 100 %). Los resultados basados ​​en ITS2 también han mostrado una mayor confiabilidad que trnL a nivel de especie, mientras que su combinación podría proporcionar una mayor sensibilidad y confiabilidad. El enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples ha demostrado buena universalidad, sensibilidad y confiabilidad en la decodificación de estas cuatro preparaciones representativas de la MTC. En la era de los big data ómicos, este trabajo sin duda ha dado un paso adelante en la aplicación del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples en el análisis de los PHM de la preparación de la MTC, hacia una mejor digitalización y modernización del control de calidad de los medicamentos.

La preparación de la Medicina Tradicional China (MTC) se ha utilizado en clínicas de China durante al menos 3000 años1,2. Se ha utilizado para prevenir y curar diversas enfermedades en China y se ha vuelto más popular en todo el mundo durante las últimas décadas. La preparación de la medicina tradicional china se compone de numerosas plantas, materiales de origen animal y/o minerales. De acuerdo con la guía de la teoría de la medicina china y la Farmacopea China (ChP)3, diferentes materiales medicinales se trituraban hasta convertirlos en polvo o se hervían, luego se mezclaban y moldeaban en pastillas junto con miel o agua para obtener una preparación de MTC (también llamada medicamento patentado). Aunque los preparados de MTC se han utilizado ampliamente en los últimos años, aún quedan muchos problemas por resolver, como el control de calidad (QC), en el que se debe centrar especial atención en sus materiales y proceso de producción para garantizar su seguridad y eficacia. La evaluación de la calidad de la MTC incluye principalmente el análisis cualitativo y cuantitativo de ingredientes químicos e ingredientes biológicos4. Los métodos actuales para el control de calidad de las preparaciones de MTC se han evaluado principalmente basándose en perfiles químicos4 (p. ej., cromatografía de capa fina (TLC)5, cromatografía líquida de alta resolución ultravioleta (HPLC-UV)6, cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas (HPLC-MS) )7). En comparación con los materiales herbarios de referencia o los compuestos específicos, los métodos TLC y HPLC pueden recuperar información sobre las especies, pero no son lo suficientemente precisos, especialmente para identificar las especies híbridas genéticamente, lo que podría producir una identificación incorrecta e introducir contaminación biológica y adulteración durante los materiales herbarios. proceso de recolección y fabricación. Sin embargo, la utilización de ADN, un fragmento que existe de manera estable en todos los tejidos8, podría identificar con precisión materiales herbarios a nivel de especie, proporcionando un mayor nivel de sensibilidad y confiabilidad, y así complementar el inconveniente del análisis químico9,10.

Hebert11 propuso el concepto de análisis de ingredientes biológicos basado en códigos de barras de ADN. Chen et al. Primero aplicaron varios códigos de barras de ADN candidatos para identificar plantas medicinales y sus especies estrechamente relacionadas12. Coghlan et al., han utilizado por primera vez códigos de barras de ADN para determinar si las preparaciones de MTC contienen derivados de especies de plantas y animales en peligro de extinción y cuyo comercio está restringido2. En 2014, Cheng et al. informaron por primera vez el análisis de ingredientes biológicos para Liuwei Dihuang Wan (LDW) utilizando el método metagenómico basado en los biomarcadores ITS2 y trnL13. Después de eso, han surgido informes sobre las hierbas de las preparaciones de MTC basadas en biomarcadores de ADN, como Yimu Wan (YMW)14, Longdan Xiegan Wan (LXW)15 y Jiuwei Qianghuo Wan (JQW)16. Curiosamente, estudios recientes han informado sobre varias preparaciones de MTC que podrían ser efectivas en la prevención y el tratamiento de COVID-1917,18, como la cápsula de Lianhua Qingwen19, los gránulos de Jinhua Qinggan19, el compuesto herbal Yiqi Qingjie20, etc. Con la ayuda de la tecnología de código de barras de ADN, Se informó que la cápsula de Lianhua Qingwen podría ser eficaz para prevenir o tratar el COVID-19, lo que podría deberse a sus ingredientes biológicos, como Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma y Rhei Radix Et Rhizome3. El mismo principio se aplica a los gránulos de Jinhua Qinggan y a los compuestos herbales de Yiqi Qingjie. Estos hallazgos enfatizaron nuevamente la importancia del análisis de ingredientes biológicos de las preparaciones de MTC utilizando el método de código de barras de ADN.

Una preparación de MTC puede considerarse como una “mezcla sintetizada de especies”, que se asemeja al objetivo analítico del enfoque metagenómico. Basándose en biomarcadores de ADN adecuados, la información genética de todos los ingredientes contenidos en el ADN podría obtenerse de forma más eficaz y rentable mediante una secuenciación de alto rendimiento. Debido a la conservación de ITS221 y su alto poder de divergencia interespecífico e intraespecífico22,23,24, así como a la conveniencia de amplificar ADN a partir de muestras muy degradadas basadas en un fragmento corto trnL25,26,27, estos dos fragmentos son generalmente elegidos como biomarcadores para la identificación de especies de hierbas. Un enfoque de este tipo basado en múltiples códigos de barras para el análisis de ingredientes a base de hierbas se conoce como “enfoque de códigos de barras múltiples” o “enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples”.

A pesar de los avances científicos de los estudios recientes, la solidez (es decir, la universalidad, la sensibilidad y la confiabilidad) del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples para identificar varios ingredientes biológicos de las preparaciones de MTC aún no está clara. Por lo tanto, seleccionamos cuatro preparaciones de MTC representativas, incluidas tres preparaciones de MTC de uso generalizado, Niuhuang Jiangya Wan (NJW), Bazhen Yimu Wan (BYW) y Yougui Wan (YGW) con composiciones simples, así como Da Huoluo Wan (DHW) con mucho. componentes más complicados, como objetivos para la evaluación de materiales herbarios mediante el uso de biomarcadores ITS2 y trnL. A partir de la evaluación de las especies herbarias prescritas (PHS) de los materiales herbarios prescritos (PHM), se evaluó la universalidad, sensibilidad y confiabilidad del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples, lo que confirmó su poder en la evaluación de los PHM para preparaciones de MTC.

Aunque recientemente se han evaluado los materiales herbales de varias preparaciones de MTC ampliamente utilizadas, incluidas LDW13, YMW14, LXW15 y JQW16, es importante elegir preparaciones representativas para una comprensión más profunda del rendimiento del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Por lo tanto, examinamos todos los ingredientes (incluidas hierbas, animales y minerales) y materiales herbarios solo para las preparaciones de MTC registradas en ChP (versión 2015) (Fig. 1A, B)3. La mayoría de las preparaciones de MTC tienen menos de 25 ingredientes y 20 materiales a base de hierbas, respectivamente. Por lo tanto, seleccionamos preparaciones de MTC con aplicación generalizada, desde composiciones simples hasta composiciones complejas, para evaluar el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Entre ellos, BYW, NJW e YGW tienen composiciones simples y DHW tiene ingredientes mucho más complejos (Fig. 1C y Tabla complementaria S1).

La distribución de todos los ingredientes y materiales herbales únicamente de todas las preparaciones de MTC enumeradas en la farmacopea china. (A) Todos los ingredientes de la preparación de MTC, incluidos los materiales vegetales, animales y minerales. (B) Los materiales herbales contenidos en una preparación de MTC. El eje x representa el número de todos los ingredientes/ingredientes a base de hierbas que contiene una preparación de MTC, el eje y significa el número correspondiente de preparaciones de MTC. Se muestran las abreviaturas, de izquierda a derecha, Yatong Yili Wan (YYW), Yimu Wan (YMW), Liuwei Dihuang Wan (LDW), Bazhen Yimu Wan (BYW), Yougui Wan (YGW), Niuhuang Jiangya Wan (NJW), Jiuwei Qianghuo Wan (JQW), Longdan Xiegan Wan (LXW) y Da Huoluo Wan (DHW), respectivamente. (C) La distribución de todos los ingredientes y el ingrediente detallado de nueve preparaciones de MTC. Se muestran las abreviaturas, de izquierda a derecha, Bazhen Yimu Wan (BYW), Da Huoluo Wan (DHW), Jiuwei Qianghuo Wan (JQW), Liuwei Dihuang Wan (LDW), Longdan Xiegan Wan (LXW), Niuhuang Jiangya Wan (NJW). ), Yougui Wan (YGW), Yimu Wan (YMW) y Yatong Yili Wan (YYW), respectivamente. Las palabras marcadas en negro son aquellas que ya se informaron en estudios anteriores, mientras que las palabras marcadas en rojo representan los preparativos de investigación utilizados en este trabajo.

Para estas cuatro preparaciones representativas de TCM, después del control de calidad (QC) preliminar (ver más detalles en la sección "Métodos"), obtuvimos 25,271,042 lecturas de secuenciación ITS2 y 27,599,145 trnL. En cada muestra se detectó un promedio de 48.493 lecturas de secuenciación ITS2 para BYW, 87.911 para DHW, 161.025 para NJW y 58.501 para YGW. Se detectaron un promedio de 57,954 lecturas trnL para BYW, 139,521 para DHW, 129,560 para NJW y 61,685 para YGW (Tabla 1). La longitud (longitud máxima, promedio y mínima) de cada secuencia obtenida de estas muestras de preparación de TCM se muestra en la Tabla complementaria S2. Luego se realizó un análisis de rarefacción para cada muestra para detectar la profundidad de la secuenciación. Todas las curvas de rarefacción alcanzaron la saturación en alrededor de 10,000 secuencias por muestra (Figura complementaria S1), lo que sugiere que la profundidad de secuenciación fue suficiente para capturar toda la información de las especies en todas las muestras para las cuatro preparaciones de TCM. Teniendo en cuenta que la base de datos trnL era más pequeña en comparación con ITS2, filtramos las especies detectadas por el código de barras ITS2 con una abundancia relativa inferior a 0,002 y las especies detectadas por el código de barras trnL con una abundancia relativa inferior a 0,001, respectivamente. Después de eso, se obtuvo una secuencia promedio de 47,533 para muestras BYW, 86,642 para muestras de DHW, 160,712 para muestras de NJW y 58,008 para muestras de YGW con base en ITS2, y 56,367 (BYW), 130,330 (DHW), 129,012 (NJW) y 59,709 ( YGW) se obtuvieron en función de trnL, respectivamente (Tabla 1).

En general, varios materiales herbáceos tienen más de un PHS. Por ejemplo, el regaliz tiene tres especies: Glycyrrhiza uralensis, Glycyrrhiza inflate y Glycyrrhiza glabra. En consecuencia, cualquier especie original de PHM debe considerarse PHS. Por ejemplo, BYW contiene ocho PHM, NJW y YGW tienen nueve PHM y DHW contiene 36 PHM, mientras que incluyen 11, 15, 10 y 57 PHS, respectivamente (Tabla 2 y Tabla complementaria S3).

Los resultados de la auditoría ITS2 en 18 muestras de BYW mostraron que en promedio se detectaron 8,2 PHS, 1,0 especies de hierbas sustituidas (SHS) y 13,8 especies de hierbas contaminadas (CHS), mientras que en 5,0 PHS, 0,3 SHS y 14,9 CHS se encontraron cada muestra trnL (Fig. 2A, B). Para DHW, cada muestra tiene un promedio de 23,7 PHS, 5,1 SHS y 21,1 CHS según ITS2, mientras que un promedio de 17,9 PHS, 6,8 SHS y 27,7 CHS según trnL (Fig. 2C, D). Para las muestras de NJW, se detectó un promedio de 7,2 PHS, 2,8 SHS y 1,8 CHS en cada muestra según ITS2, que era más que trnL (3,0 PHS, 3,0 SHS y 24,0 CHS; Fig. 2E, F). Los valores medios de PHS, SHS y CHS detectados en cada muestra de YGW fueron 4,8, 0,9 y 10,4 según ITS2, y 3,7, 0,5 y 17,3 según trnL, respectivamente (Fig. 2G, H). Estas diferencias pueden deberse en parte a la integridad de las bases de datos ITS2 y trnL, así como a sus propiedades de resolución intrínsecas.

La distribución de las especies detectadas en cuatro preparaciones representativas de MTC compradas a dos fabricantes basadas en ITS2 y trnL. (A) Muestras BYW basadas en ITS2; (B) Muestras BYW basadas en trnL; (C) Muestras de ACS basadas en ITS2; (D) Muestras de ACS basadas en trnL; (E) Muestras de NJW basadas en ITS2; (F) Muestras de NJW basadas en trnL. (G) Muestras de YGW basadas en ITS2; (H) Muestras YGW basadas en trnL. Especies de hierbas prescritas por PHS, especies de hierbas sustituidas por SHS, especies de hierbas contaminadas con CHS.

En resumen, el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples podría detectar los materiales a base de hierbas, incluidos los materiales prescritos, sustituidos y contaminados, para preparaciones representativas de la medicina tradicional china (incluidos BYW, DHW, NJW y YGW). El resultado ha demostrado que el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples tiene una buena universalidad en la detección de PHM a partir de muestras de preparación de MTC.

Se realizaron más investigaciones para detectar la composición de las preparaciones de MTC, elegimos una preparación de MTC (NJW) con una composición relativamente simple y una aplicación generalizada, y otra preparación de MTC (DHW) con ingredientes más complejos, como objetivos para decodificar sus PHM mediante la identificación de sus PHS de cada preparación de TCM según los conjuntos de datos ITS2 y trnL, respectivamente.

El resultado de la auditoría ITS2 en muestras de NJW reveló que podía detectar con éxito todos los PHM (9 materiales a base de hierbas), incluidos los materiales a base de hierbas procesados ​​(como el extracto de Scutellaria), que cubren 12 PHS detectados (Tabla 3, Fig. 3A y Fig. Suplementaria). .S2C). Senna obtusifolia (la abundancia relativa promedio fue del 48,4%) y Senna tora (45,4%) fueron las especies dominantes en todas las muestras, seguidas por Paeonia lactiflora (3,4%) y Ligusticum chuanxiong (1,0%). Los resultados sugirieron que el método CTAB modificado era adecuado para extraer su ADN y que los cebadores eran más adecuados para amplificar sus secuencias. Además de los PHS, también se encontraron siete SHS pertenecientes a Codonopsis, Ligusticum, Mentha, Paeonia y Senna (su abundancia relativa media fue del 0,035%) y seis posibles géneros contaminados, a saber, Ipomoea, Amaranthus, Anemone, Cuscuta, Pogostemon y Zanthoxylum, que podrían introducirse durante el experimento biológico o el proceso de fabricación.

La distribución de especies herbarias prescritas (PHS) detectadas en cada muestra de preparados de NJW y DHW. (A) El PHS detectado en muestras de NJW según ITS2; (B) El PHS detectado en muestras de NJW según trnL; (C) El PHS detectado en muestras de ACS según ITS2; (D) El PHS detectado en muestras de ACS según trnL. Tenga en cuenta que cada columna representa una muestra y cada fila representa un PHS. En el mapa de calor que se dibujó en el paquete “pheatmap” de R (versión 3.5.2) (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html), el color representa la abundancia relativa de PHS (normalizado según columna) detectados en esta muestra. El número "1" representa el PHS que se detectó en esta muestra, mientras que "0" representa el PHS que no se detectó.

Para la preparación de ACS, detectamos 35 PHS que cubren 25 PHM, incluidos los materiales herbales procesados ​​como el Baishu salteado. La sensibilidad de los PHM fue del 69,4% según ITS2 (Tabla 4, Figs. 3C, 4A). Entre los PHS detectados en 18 muestras, se encontraron 15 PHS con una abundancia relativa promedio superior al 0,1%, donde se identificaron siete PHS con una abundancia relativa promedio superior al 1%, incluyendo Angelica sinensis (2,0%), Asarum sieboldii (1,2%), Notopterygium franchetii (1,9%), Notopterygium incisum (1,8%), Paeonia lactiflora (5,3%), Paeonia veitchii (2,0%) y Pogostemon cablin (3,7%). En todas las muestras se encontraron tres PHS (Clematis hexapetala, Coptis teeta, Paeonia lactiflora). Entre ellos, Paeonia lactiflora estaba altamente enriquecida en muestras de ACS.A. La abundancia relativa promedio de Glycyrrhiza uralensis (1,56%) y Osmunda japonica (1,64%) detectada en muestras de DHW.A fue 1,6 veces mayor que la de las muestras de DHW.B (Glycyrrhiza uralensis (0,94%) y Osmunda japonica (0,98%)). Mientras que Coptis deltoidei (una lectura detectada en DHW.A.III3), Ephedra intermedia (tres lecturas detectadas en DHW.A.III2), Gastrodia elata (una lectura en DHW.A.III3) y Rheum tanguticum (tres lecturas detectadas en DHW .B.III1) sólo se detectaron en una muestra. Cabe destacar que los SHS, pertenecientes a Anemone nemorosa (0,31%) que tienen el mismo género que PHS, se encontraron con alta abundancia relativa en la mayoría de las muestras, especialmente en DHW.A.II y DHW.A.III, que podrían ser introducidos durante Procesamiento del fabricante o experimento biológico.

Análisis filogenético de las especies representativas que tuvieron al menos 0,1% de abundancia relativa en muestras de ACS. (A) Basado en ITS2; (B) Basado en trnL. Los árboles filogenéticos de las especies se visualizan en iTOL (https://itol.embl.de/). La rama del árbol representa la clasificación taxonómica de las especies. La palabra marcada en rojo significa las especies de hierbas prescritas y la barra colorida significa la abundancia relativa promedio de especies en los tres lotes de los dos fabricantes (A, B).

Para NJW, se detectaron siete PHS pertenecientes a cuatro géneros con baja abundancia, incluidos Codonopsis pilosula, Curcuma kwangsiensis, Curcuma longa, Curcuma phaeocaulis, Nardostachys chinensis, Nardostachys jatamansi, Scutellaria baicalensis (Tabla 5, Fig. 3B y Fig. Suplementaria S2D). Entre ellos, Nardostachys chinensis fue capturado en todas las muestras, mientras que Codonopsis pilosula y Nardostachys jatamansi solo fueron identificados en una muestra con una lectura, lo que sugirió que el ADN de estas especies de baja abundancia relativa era difícil de extraer o los cebadores trnL c/h no eran adecuados para su determinación. Los sustituidos Astrágalo (3,9%) y Mentha (8,1%) se identificaron con alta abundancia relativa. En cuanto a los posibles CHS, se distribuyeron dispersamente en 52 géneros.

Para las muestras de ACS basadas en trnL, debido a sus complejos ingredientes biológicos, la sensibilidad de los PHM (18 PHM, 22 PHS) fue solo del 50 % (Tabla 6, Figs. 3D y 4B). Entre los 22 PHS detectados, 12 de ellos (Tabla 6) se detectaron en todas las muestras con una abundancia relativa promedio superior al 0,1%, excepto Coptis chinensis (0,05%), en el que seis de ellos superaron el 1%, 10 de 22 PHS estuvieron por debajo 0,05%. Además, la abundancia relativa de 22 PHS que se detectaron en ACS.A fue mayor que ACS.B. Boswellia negligencia (6,4%) fue la especie dominante, seguida de Glycyrrhiza uralensis (4,2%) y luego Coptis deltoidei (2,6%). Sin embargo, Ephedra equisetina (12 lecturas en DHW.A.II3 y 8 lecturas en DHW.A.III3) y Scrophularia ningpoensis (una lectura tanto en DHW.A.I2 como en DHW.A.III1) solo se encontraron en dos muestras. La razón de este PHS poco abundante podría deberse al procesamiento por parte de los fabricantes. Por ejemplo, los materiales Baishu salteados, Xiangfu procesado con vinagre y otros materiales pueden hervirse o freírse antes de agregarse a una preparación de MTC, lo que daña su ADN.

El análisis de la sensibilidad en muestras BYW y YGW basado en el biomarcador ITS2 y trnL se muestra en las tablas complementarias S4 a S7, figuras complementarias S2A – B, E – F. Comparando el resultado del análisis de DHW y NJW, NJW solo contiene un PHM preprocesado (extracto de Scutellaria), mientras que DHW tiene siete PHM preprocesados. Al comparar el resultado con el biomarcador ITS2, se identificaron muchas menos especies utilizando el biomarcador trnL, lo que podría deberse a la extracción de ADN, la especificación del cebador y la limitación de la base de datos trnL de Genbank. Las tres réplicas biológicas de estos lotes han mostrado diferentes composiciones de PHS basadas tanto en ITS2 como en trnL (Fig. 3, Fig. 4, Tablas 3, 4, 5 y 6, Figuras complementarias S2-S3 y Tablas complementarias S4-S7) , que podría ser potencialmente causado por la extracción de ADN, la amplificación por PCR y la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Las investigaciones anteriores de LDW13, YMW14, LXW15 y JQW16 también han demostrado este fenómeno.

Todas las especies detectadas, incluidas PHS, SHS y CHS de estas cuatro preparaciones de TCM (BYW, DHW, NJW y YGW), también se proporcionaron en las tablas complementarias S8 a S15. Según el biomarcador ITS2, detectamos ocho, 25, nueve y seis PHM de BYW, DHW, NJW y YGW, respectivamente. La proporción detectada de PHM fue del 100% para BYW y NJW, seguidas de DHW (69,4%) y YGW (66,7%). En cuanto a trnL, se detectaron cinco, 18, cuatro y cuatro PHM de BYW, DHW, NJW y YGW, respectivamente. La sensibilidad máxima de los PHM fue del 62,5% entre las cuatro preparaciones de MTC en este experimento. El análisis sugirió firmemente que el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples tiene una alta sensibilidad para identificar los PHM de las preparaciones de MTC, especialmente en función del conjunto de datos ITS2.

Además, construimos un modelo para diferenciar la muestra de diferentes fabricantes y lotes de muestras. Aquí, calculamos las distancias euclidianas para cada par de muestras y luego agrupamos las muestras según su similitud. Tomamos el ACS como caso de estudio. Los resultados mostraron que la mayoría de las muestras de DHW de los fabricantes A y B se agruparon en función de los biomarcadores ITS2 (Fig. 5A, B) y trnL (Fig. 5C, D), lo que sugiere una alta similitud de las muestras intrafabricantes. Las muestras compradas de DHW.A.II y DHW.A.III se agruparon con muestras de DHW.B, mientras que tres muestras compradas de DHW.AI se reunieron, pero estaban distantes de las otras muestras (Fig. 5A, B). ). Esta separación podría deberse a la existencia de SHS como Senna, Amaranthus, Glycine y CHS como Arachis, Brassica, Solanum y Oryza. En cuanto a NJW (Figura complementaria S4), las muestras de dos fabricantes (A&B) se dispersaron, según ITS2 o trnL, mientras que las muestras de cada fabricante se agruparon según los lotes (I, II, III), que Describió la alta consistencia entre lotes de muestras de NJW. Los resultados del análisis de conglomerados de muestras BYW y YGW (Figuras complementarias S5-S6) mostraron una clara diferencia entre fabricantes, así como una alta similitud dentro del mismo fabricante.

Comparación de la similitud de todas las muestras de ACS de dentro o entre fabricantes basándose en materiales vegetales prescritos utilizando distancias euclidianas. Los grupos de mapas de calor mostraron la distancia de todas las muestras en función de la existencia de especies de hierbas prescritas mediante agrupación jerárquica, y los grupos de redes ilustraron estas diferencias basándose en los resultados de secuenciación de ITS2 (A, B) y trnL (C, D), respectivamente. Para el mapa de calor (A,C), que se dibujó en el paquete “pheatmap” de R (versión 3.5.2) (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html), las barras de color de degradado significan la distancia entre dos muestras cualesquiera, mientras que el color rojo y azul representan las dos distancias extremas entre muestras. Para la red (B,D) que se visualizó en Cytoscape (versión 3.7.1; https://cytoscape.org/), cada borde representa la distancia de dos muestras cualesquiera con una distancia menor o igual a 5.0 para ITS2 y 4.2 para trnL.

También se realizó un análisis PCA para explorar la consistencia de muestras de dos fabricantes. Las muestras de DHW.B se agruparon más estrechamente que las de DHW.A según el biomarcador ITS2 y trnL. Según ITS2, las muestras de ACS de dentro del lote se agruparon, mientras que las muestras entre lotes se distribuyeron escasamente. Por el contrario, según trnL, las muestras de DHW.A estaban muy dispersas (Figura complementaria S7C, D), lo que sugirió que la consistencia de las muestras de DHW.B era mejor que la de DHW.A. Las muestras de NJW (Figura complementaria S7E, F) se agruparon de manera más dispersa que DHW. El resultado de BYW y YGW (Figura complementaria S7A, B, G, H) también mostró resultados similares.

Para investigar las especies que impulsaron la diferencia de muestras entre fabricantes, se realizó un análisis LEfSe para descubrir biomarcadores. Se identificaron 13 PHS de DHW.A y cuatro de DHW.B como biomarcadores provisionales (lista en la Fig. 6A). Mediante mRMR se seleccionaron cinco PHS de ACS.A y dos PHS de ACS.B. Luego, utilizamos la puntuación MEI (fórmula (1)) para evaluar su desempeño (Fig. 6B). Como el área bajo la curva ROC de Glycyrrhiza glabra era inferior a 0,5, eliminamos este biomarcador del DHW.A. Así, se eligieron Coptis chinensis, Ephedra equisetina, Lindera agregado y Panax ginseng como biomarcadores únicos de DHW.A. Se seleccionaron Rheum palmatum y Clematis hexapetala como biomarcadores representativos de DHW.B. Todos ellos son de alto poder de discriminación (Fig. 6B), que podrían usarse por separado o en combinación para diferenciar las muestras de los dos fabricantes. Además del análisis ROC, también utilizamos la precisión y la puntuación F1 para evaluar el rendimiento de estos biomarcadores (Tabla complementaria S16), que fueron respaldados por el modelo de bosque aleatorio.

La diferencia de muestras de los dos fabricantes (A, B) podría deberse a algunas especies herbarias de ACS prescritas discriminatorias que utilizan el biomarcador ITS2. (A) Los biomarcadores heredados seleccionados por LEfSe; (B) Curvas ROC para visualizar la puntuación MEI de los biomarcadores heredados después de eliminar los marcadores redundantes de los dos fabricantes.

Al detectar sus PHS, la proporción detectada de PHM fue del 100% para BYW y NJW, seguidas por DHW (69,4%) y YGW (66,7%) según ITS2, mientras que 62,5%, 50%, 44,4% y 44,4% para BYW, DHW, NJW y YGW basados ​​en conjuntos de datos trnL respectivamente (Tabla 7). La sensibilidad de ITS2 fue mejor que la de trnL en todas las preparaciones de MTC, pero el biomarcador trnL también pudo detectar el PHS de los PHM que ITS2 no pudo (Boswellia negligencia y Rehmannia glutinosa). La unión de ambos biomarcadores podría detectar más PHS, proporcionando un resultado detectado más fiable (en cuanto a detecciones positivas).

Como se puede observar en el diagrama de Venn (Fig. 7), se detectaron todos los PHM de BYW. En cuanto al ACS, el resultado de detección de uniones de estas dos regiones fue de 38 PHS, cubriendo 28 PHM, lo que aumentó la eficiencia de identificación al 77,8%. De manera similar, el resultado de la detección de trnL de la preparación de NJW fue un subconjunto de ITS2 (100 % de sensibilidad). Para las muestras de YGW, la unión de estos dos biomarcadores aumentó la sensibilidad al 77,8%. Este resultado también ha confirmado la alta confiabilidad del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Luego comparamos nuestro resultado con los estudios anteriores, incluidos JQW, LXW, YMW y YYW (Tabla 8), que indicaron la confiabilidad del enfoque de códigos de barras múltiples. Esto también sugirió que la complejidad de los ingredientes biológicos de la preparación de la medicina tradicional china también ha afectado negativamente a los resultados detectados.

Las especies herbarias prescritas específicas y compartidas de preparaciones de MTC basadas en ITS2 y trnL. (A) BYW; (B) ACS; (C) Nueva Jersey; (D) YGW. Los números debajo del diagrama de Venn significan la cantidad de especies de hierbas prescritas detectadas según ITS2, trnL únicamente y la intersección de las dos.

Aunque se ha demostrado la sensibilidad y confiabilidad del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples, la sensibilidad de ITS2 y trnL es diferente. ITS2 mostró una mayor sensibilidad que la de trnL para la detección de PHM, lo que puede deberse a que hay más registros y una región de ITS2 conservada por más tiempo. Sin embargo, el papel de trnL es insustituible, ya que podría complementar ITS2 para una identificación más confiable de los PHM de las preparaciones de MTC, especialmente para el análisis de ingredientes biológicos de DHW y YGW en este trabajo.

Como ya sabemos, los materiales a base de hierbas son los elementos más esenciales en diferentes medicinas tradicionales. Se ha publicado un número cada vez mayor de artículos sobre la autenticación de hierbas individuales basada en el ADN26,28,29,30,31,32,33, mientras que se informaron algunas aplicaciones del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples para preparaciones de MTC13,34,35. 36.

En este trabajo, el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples ha detectado con éxito las especies (incluidas las especies prescritas, sustituidas y contaminadas) en una muestra con alta sensibilidad, lo que indica la buena universalidad del método y su valor potencial para la supervisión diaria de la MTC. Como pudimos determinar la existencia de todas las especies en una muestra a nivel de especie, estos resultados han indicado una sensibilidad adecuada de este método para decodificar materiales herbales de preparaciones de MTC mediante la autenticación de sus especies correspondientes. La combinación de ITS2 y trnL ha alcanzado una alta sensibilidad (mínima: 77,8%, máxima: 100%), destacando el valor de aplicación práctica y la alta confiabilidad de este enfoque. En particular, el ITS2 mostró una excelente capacidad y sensibilidad para identificar materiales herbales. Aunque la resolución de trnL era menor que la de ITS2, también podría reforzar o complementar ITS2 para obtener resultados más confiables. Estos resultados han demostrado que la secuenciación de códigos de barras múltiples era una herramienta eficaz para decodificar los materiales herbales de varias preparaciones de MTC.

Por ejemplo, para BYW y NJW, todos los PHM se detectaron autenticando sus PHS correspondientes. Los PHS detectados de ACS fueron 35 (cubrieron 25 PHM), 22 de ellos (cubrieron 18 PHM) según ITS2 y trnL, respectivamente. El conjunto de datos de unión de ITS2 y trnL ha aumentado la sensibilidad aumentando del 69,4% al 77,8% para las muestras de ACS. Sin embargo, no se detectaron seis PHM en todas las muestras de ACS según ITS2 o trnL. Estos fenómenos podrían ser causados ​​por diversos procedimientos de preprocesamiento, como materiales herbales decocidos o salteados, cuyo ADN resultó dañado o degradado. También observamos que debido a varios factores que influyen, como la ubicación geológica, las condiciones de cultivo, el clima y otras condiciones, la sensibilidad de los PHM de cada muestra de preparación de TCM es diferente.

El enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples podría ayudar a identificar el PHS de los PHM siempre que su ADN no esté completamente dañado. Sin embargo, en estudios futuros aún es necesario llevar a cabo una mejora más profunda y completa de este enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Era necesaria una base de datos de especies más completa, ya que la confiabilidad del análisis de ingredientes biológicos para la preparación de MTC depende en gran medida de la base de datos de referencia2. En nuestro estudio futuro, podemos utilizar múltiples bases de datos, incluida la base de datos GenBank, así como la base de datos tcmbarcode37, EMBL, DDBJ y PDB2 para obtener resultados más completos. Además, se pueden considerar más candidatos a biomarcadores para evaluar la calidad de la preparación de la MTC.

En primer lugar, el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples podría ser un intento de identificar los materiales animales, porque los materiales animales todavía son un componente importante de la MTC y a menudo se combinan con hierbas medicinales para ejercer sus efectos farmacológicos38.

En segundo lugar, el análisis de ingredientes químicos basado en TLC y HPLC, así como el análisis de ingredientes biológicos basado en secuenciación de múltiples códigos de barras, son partes relativamente independientes pero indivisibles para las evaluaciones de calidad de las preparaciones de MTC. La TLC y la HPLC se centran en compuestos químicos, mientras que la secuenciación de códigos de barras múltiples se centra en la identificación de especies. En lo que respecta a una mayor sensibilidad en la identificación de especies, la tecnología de secuenciación de códigos de barras múltiples fue superior a la HPLC y la TLC. Sin embargo, al combinar los métodos químicos con el método de códigos de barras de ADN, la detección de ingredientes de la MTC podría ser más completa. Aunque nuestro grupo10 puso a prueba inicialmente esta idea, todavía hay margen de mejora.

En tercer lugar, el enfoque de farmacología en red nos ha proporcionado una visión más directa de las interacciones fármaco-objetivo39, lo que nos da una idea de cómo optimizar los fármacos existentes y descubrir nuevos medicamentos para satisfacer los requisitos de superar enfermedades complejas. Por lo tanto, se debe considerar el uso farmacológico en el control de calidad de las preparaciones de MTC, especialmente para usos específicos, como el control de calidad basado en mecanismos de YIV-90640. Esta teoría también nos ha inspirado a explorar los tratamientos potenciales de la COVID-19 a partir de ingredientes biológicos de las preparaciones de la MTC41. Los ingredientes como Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma podrían interactuar frecuentemente con el objetivo de COVID-19: ACE219,41. A través de la extracción de datos, las características de ocho ingredientes biológicos del ACS corresponden a los síntomas clásicos de diferenciación del síndrome de la enfermedad cálida de COVID-19, que podrían resultar eficaces para tratar el COVID-1941. Si se combina con datos de salud pública, esta información sobre ingredientes biológicos podría arrojar más luz sobre la susceptibilidad de un paciente que ha tomado estas preparaciones de MTC, especialmente aquellas personas de edad avanzada.

Por último, muchas medicinas a base de hierbas se toman por vía oral42, sin duda expuestas a toda la microbiota del tracto gastrointestinal, lo que proporciona suficientes oportunidades espaciotemporales para interacciones directas o indirectas. Por ejemplo, la berberina, el principal ingrediente farmacológico del rizoma de Coptidis43, promueve la producción de ácidos grasos de cadena corta para cambiar la estructura de la microbiota intestinal, mientras que la berberina poco solubilizada44 se convirtió en dihidroberberina mediante una reacción de reducción mediada por la nitroreductasa bacteriana y luego se recuperó para formar la forma original después de penetrar los tejidos de la pared intestinal45, a través de interacciones, la diversidad microbiana en los intestinos de ratones con dieta alta en grasas disminuyó profundamente46.

Creemos que estos esfuerzos en materia de control de calidad de los preparados de medicina tradicional china podrían unirse y proporcionar enfoques mucho mejores para el sistema de control de calidad de preparación de medicina tradicional china de próxima generación. Al remodelar la composición microbiana simbiótica, podríamos proporcionar nuevas estrategias terapéuticas para acelerar la realización de terapias personalizadas.

En conjunto, el enfoque de secuenciación de múltiples códigos de barras se examinó sistemáticamente con alta universalidad, sensibilidad y confiabilidad. ITS2 muestra una mejor capacidad de identificación, pero trnL podría detectar varios PHS o PHM (como Boswellia negligencia y Rehmannia glutinosa) que ITS2 no pudo y, por lo tanto, complementar ITS2 para obtener resultados más confiables. A través del enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples, hemos detectado entre 77,8% y 100% de PHM para estas preparaciones representativas de MTC, que no podrían lograrse mediante métodos tradicionales, como medios morfológicos y bioquímicos. En el futuro, este enfoque podría evaluar conjuntos más diversos de preparaciones de MTC, lo que permitirá identificar las preparaciones de MTC de manera sistemática y acelerará la digitalización y modernización del control de calidad de las preparaciones de MTC.

El flujo de trabajo para el procedimiento de análisis de preparación de TCM también se proporciona en la Fig. 8.

Un flujo de trabajo para los procedimientos de análisis de preparación de TCM. Este flujo de trabajo incluye principalmente cuatro partes: (1) recopilación de preparativos de MTC: Baizhen Yimu Wan (BYW), Da Huoluo Wan (DHW), Niuhuang Jiangya Wan (NJW) y Yougui Wan (YGW); (2) Preparación y secuenciación de muestras: extracción de ADN, amplificación por PCR, purificación, secuenciación; (3) Control de calidad: filtrado de lecturas sin procesar y filtrado de especies; (4) Identificación de especies y comparación de muestras: detección de especies de hierbas prescritas (PHS), detección de especies de hierbas sustituidas (SHS), detección de especies de hierbas contaminadas (CHS), análisis filogenético, análisis de PCA, análisis de redes e índice ambiental basado en microbios ( MEI) modelo de predicción para la evaluación de preparaciones de MTC.

Se recolectaron cuatro preparaciones de MTC, cada una comprada de dos fabricantes diferentes (marcadas como A y B) con tres lotes (I, II y III) (Tabla complementaria S17). Cada lote se implementó con tres réplicas biológicas basadas en ITS2 y trnL, respectivamente. Por tanto, se utilizaron 144 muestras para el experimento posterior. Aquí, damos un ejemplo para aclarar la regla de nomenclatura de SampleID: DHW.A.I1 significa que la muestra de DHW se compró al fabricante A y fue una de las tres réplicas biológicas (I1) del primer lote (I).

Para la extracción de ADN, utilizamos un método optimizado de bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) (TCM-CTAB)47. Cada muestra (1,0 g) se disolvió completamente con Tris-HCl 0,1 M, EDTA 20 mM (pH 8,0, 2 ml). La solución disuelta (0,4 ml) se diluyó con tampón de extracción (0,8 ml) que consistía en CTAB al 2 %; Tris-HC1 0,1 M (pH 8,0); EDTA 20 mM (pH 8,0); NaCl 1,4 M, y luego 100 μL de SDS al 10 %, 10 μL de 10 mg/mL de proteinasa K (Sigma, MO, EE. UU.) y 100 μL de β-mercaptoetanol (Amresco, OH, EE. UU.) y se incubaron a 65 °C durante 1 h con remolinos ocasionales. La proteína se eliminó extrayendo dos veces con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), y una vez con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El sobrenadante se incubó a -20 °C con 0,6 veces de isopropanol frío durante 30 minutos para precipitar el ADN. El precipitado se lavó con etanol al 75%, se disolvió y se diluyó a 10 ng/μl con tampón TE y luego se usó como plantilla de amplificación por PCR. La concentración de ADN se cuantificó en un fluorómetro Qubit2.0.

La amplificación por PCR se realizó en una mezcla de reacción de 50 μL que contiene 1 μL de ADN extraído de preparaciones de TCM, 10,0 μL de tampón PrimeSTAR 5 × (Mg2+ plus) (TaKaRa), 2,5 μL de dNTP 10 μM (TaKaRa), 0,5 μL cada uno. de cebadores directos e inversos (10 μM), 2,5 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y 0,5 μL de ADN polimerasa PrimeSTAR HS (Takara, 2,5 U/μL). Para la amplificación y secuenciación de la región ITS2, se diseñaron los cebadores directos S2F12 y el cebador inverso ITS448 (Tabla complementaria S18) con etiquetas MID de siete pb (Tabla complementaria S19) para la amplificación por PCR. Las reacciones de PCR se implementaron de la siguiente manera: desnaturalización previa a 95 °C durante cinco minutos, luego 10 ciclos compuestos por 95 °C durante 30 s y 62 °C durante 30 s con un aumento de -1 °C por ciclo, seguido de 72 °C por 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 72 °C por 30 s; el procedimiento finalizó con 72 °C por 10 min. Para la región trnL, los cebadores directos trnL-c y el cebador inverso trnL-h con etiquetas MID de 7 pb (Tabla complementaria S19) también se diseñaron para la amplificación por PCR. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo según las condiciones: predesnaturalización a 95 °C durante 5 min, 10 ciclos compuestos por 95 °C durante 30 s y 62 °C durante 30 s con rampas de −1 °C por ciclo. seguido de 72 °C durante 30 s; luego seguido de 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 58 °C por 30 s y 72 °C por 30 s; el procedimiento finalizó con 72 °C por 10 min. Para un mejor efecto de amplificación se realizó PCR de touchdown48,49. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). La concentración de ADN se cuantificó en un fluorómetro Qubit2.0. Después de retirar una muestra BYW marcada con trnL que no se pudo amplificar, lo que potencialmente fue causado por una inhibición severa de la PCR, y una muestra YGW marcada con ITS2 que no se pudo construir en la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación, 142 muestras (Tabla complementaria S20) se enviaron para secuenciación de extremos de pares de Illumina MiSeq PE300. Los datos de secuenciación sin procesar para las muestras de preparación de TCM se depositaron en la base de datos NCBI SRA con el número de acceso PRJNA562480.

Primero utilizamos FastQC (versión 0.11.7) con parámetros predeterminados para evaluar la calidad de las lecturas de secuenciación. Las lecturas de la misma muestra se ensamblaron utilizando el script QIIME 'join_paired_end.py'. Luego usamos 'extract_barcodes.py' para extraer los códigos de barras de doble extremo de todas las lecturas, y 'split_libraries_fastq.py' se usó para dividir la muestra según sus códigos de barras (Tabla complementaria S19) de los datos de secuenciación mixta. También utilizamos sus parámetros '-q 20 --max_bad_run_length 3 --min_per_read_length_fraction 0.75 --max_barcode_errors 0-barcode_type 7' para filtrar preliminarmente las secuencias de baja calidad, luego se usó el software Cutadapt (versión 1.14) para eliminar los cebadores (Tabla complementaria S18) y adaptador de todas las muestras.

Estas lecturas de todas las muestras fueron sometidas a control de calidad mediante MOTHUR50 (versión 1.41.0). Se eliminaron las lecturas por cada de ITS2 cuya longitud es <150 pb o> 510 pb y las lecturas de trnL cuya longitud es <75 pb. Después de eso, descartamos la secuencia cuyo puntaje de calidad promedio estaba por debajo de 20 en cada ventana deslizante de cinco pb junto con las lecturas completas. Las secuencias que contenían llamadas de bases ambiguas (N), homopolímeros de más de ocho bases o cebadores no coincidentes, códigos de barras incorrectos, también se eliminaron de los conjuntos de datos ITS2 y trnL.

Para asignar anotaciones taxonómicas para cada secuencia, utilizamos BLASTN (valor e = 1e −10) para buscar en las bases de datos ITS2 y trnL basadas en GenBank51, respectivamente. Entre todos los resultados, primero elegimos el PHS con la puntuación más alta; de lo contrario, seleccionamos las especies con la puntuación más alta como especies objetivo para la secuencia. Además, también buscamos manualmente todos los PHS de PHM en todas las muestras. Luego, descartamos las especies correspondientes de las secuencias ITS2 y trnL con abundancia relativa inferior a 0,002 y 0,001, respectivamente. El análisis de rarefacción se realizó con R52 (versión 3.5.2) utilizando el paquete "vegano" para evaluar la profundidad de secuenciación de las muestras de preparación de TCM (Código 1 para análisis de rarefacción en Materiales complementarios).

En cuanto a la composición de PHS, utilizamos el mapa de calor con color degradado usando el paquete “pheatmap” de R (versión 3.5.2) (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html) para ilustrar la composición del PHS en función de su abundancia relativa en cada muestra, y utilizó 0 (no detectado) y 1 (detectado) para describir el estado de existencia de PHS en cada muestra. Para la filogenia de las especies, primero obtuvimos sus árboles filogenéticos de la taxonomía NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi). Luego, visualizamos estos árboles filogenéticos en iTOL (https://itol.embl.de/). Los círculos interior y exterior indican la abundancia relativa de esta especie en los fabricantes A y B, respectivamente. Cada círculo tiene tres colores, que representan la abundancia relativa de especies en tres lotes. La distancia entre dos muestras cualesquiera se calculó mediante la distancia euclidiana en función de la existencia de especies herbarias prescritas. Luego visualizamos la distancia muestra-muestra en el mapa de calor con agrupación jerárquica en el paquete “pheatmap” de R (versión 3.5.2) (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html). Al utilizar la muestra como nodo y la distancia de dos muestras cualesquiera como borde, construimos un grupo de red para cada preparación de TCM y lo visualizamos en Cytoscape (versión 3.7.1)53 basado en ITS2 y trnL, respectivamente. También se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para detectar la diferencia entre dos fabricantes (Código 2 para análisis de PCA en materiales complementarios). También utilizamos el tamaño del efecto LDA (LEfSe)54 para seleccionar biomarcadores heredados y luego realizamos la selección de características utilizando la selección de características de máxima relevancia y redundancia mínima (mRMR)55 para seleccionar los biomarcadores más discriminativos. Para garantizar el rendimiento de los biomarcadores seleccionados, también utilizamos un índice integrado definido como puntuación del índice ambiental basado en microbiomas (MEI). Es decir, la relación de AUr(Si) y BUr(Sj), definida como:

donde AUr (Si) y BUr (Sj) representan la abundancia relativa de los biomarcadores seleccionados i o j para los dos fabricantes A y B hasta LEfSe y mRMR, respectivamente.

Se aplicó el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC)56 para visualizar la efectividad de clasificación (puntuación MEI) del biomarcador seleccionado de diferentes fabricantes. También utilizamos el bosque aleatorio (paquete “randomforest” en R) para evaluar el rendimiento de los biomarcadores seleccionados, que tuvo en cuenta la precisión, la puntuación F1 y la ROC. Los datos y la configuración de los parámetros se describieron detalladamente en nuestro estudio anterior57.

Los materiales a base de hierbas prescritos se definieron como los materiales a base de hierbas de una preparación de MTC registrada en ChP, abreviada como MSP.

Las especies de hierbas prescritas (abreviadas como PHS) eran las especies originales de PHM, cualquiera de ellas debe considerarse como PHS.

Las especies que tienen el mismo género que PHS, se definieron como especies herbarias sustituidas (SHS). La especie excluida de las dos especies anteriores se consideró especie herbaria contaminada (CHS).

Para comprender mejor las abreviaturas utilizadas en este trabajo, tomamos una preparación de MTC, YGW, como ejemplo, como se muestra en la Tabla 2. La información para otras preparaciones de MTC se muestra en la Tabla complementaria S3. También proporcionamos información detallada sobre los materiales animales y minerales para las cuatro preparaciones de MTC en la Tabla complementaria S1.

La universalidad fue una medida para evaluar cómo el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples podría aplicarse a una amplia gama de preparaciones de MTC. Para ello se seleccionaron cuatro preparados representativos de la medicina tradicional china.

La sensibilidad se definió como la relación entre el número de PHM detectados y el número de PHM que podrían identificarse en teoría, es decir,

La confiabilidad se definió como el número de PHM detectables de las preparaciones de MTC mediante el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Cuanto mayor sea el número de PHM detectables, mayor será la confiabilidad.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en la base de datos NCBI SRA con número de acceso PRJNA562480 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA562480/).

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Este trabajo fue financiado parcialmente por la Fundación Nacional de Ciencias de China [Números de subvención: 81573702, 81774008, 31871334, 31671374]; Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China [Número de subvención: 2018YFC0910502]. También reconocimos que este manuscrito se publicó como preimpresión en BioRxiv58, al que se puede acceder en https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.29.177188v1.

Estos autores contribuyeron igualmente: Qi Yao y Xue Zhu.

Laboratorio Clave de Biofísica Molecular del Ministerio de Educación, Laboratorio Clave de Bioinformática e Imágenes Moleculares de Hubei, Centro de Biología de IA, Departamento de Bioinformática y Biología de Sistemas, Facultad de Ciencias y Tecnología de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, 430074 , Hubei, China

Qi Yao, Xue Zhu, Maozhen Han, Chaoyun Chen, Hong Bai y Kang Ning

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Toho, Tokio, 1438540, Japón

wei li

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KN y HB diseñaron el estudio. QY, MH y CC recogieron las muestras y realizaron la extracción y secuenciación del ADN. XZ analizó los datos y escribió el manuscrito. KN, BH, XZ y WL revisaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Correspondencia a Hong Bai o Kang Ning.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Yao, Q., Zhu, X., Han, M. et al. Decodificación de materiales herbales de preparaciones de MTC con el enfoque de secuenciación de códigos de barras múltiples. Informe científico 12, 5988 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-09979-z

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Recibido: 25 de octubre de 2021

Aceptado: 29 de marzo de 2022

Publicado: 09 de abril de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-09979-z

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