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Jun 04, 2023

La geometría y la dinámica de la segregación celular en 3D se rigen por la regulación de la tensión superficial del tejido

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 817 (2023) Citar este artículo 521 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics La morfogénesis y los patrones de los tejidos durante el desarrollo implican la segregación de

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 817 (2023) Citar este artículo

521 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

La morfogénesis y los patrones de los tejidos durante el desarrollo implican la segregación de tipos de células. La segregación es impulsada por tensiones superficiales de tejido diferenciales generadas por tipos de células mediante el control de la formación de contacto entre células mediante la regulación de la adhesión y las tensiones corticales celulares basadas en la contractilidad de la actomiosina. Utilizamos tipos de células de tejido de vertebrados y progenitores de la capa germinal del pez cebra como modelos in vitro de segregación heterotípica tridimensional y desarrollamos un análisis cuantitativo de su dinámica basado en microscopía de lapso de tiempo 3D. Mostramos que la inhibición general de la contractilidad de la actomiosina por el inhibidor de la quinasa Rho Y27632 retrasa la segregación. La inhibición específica del tipo celular de la actividad de la miosina 2 no muscular mediante la sobreexpresión del inhibidor del ensamblaje de miosina S100A4 reduce la tensión superficial del tejido, que se manifiesta en una disminución de la compactación durante la agregación y la geometría invertida observada durante la segregación. Lo mismo se observa cuando expresamos una isoforma Rho quinasa constitutivamente activa para mantener alta la contractilidad de la actomiosina de manera ubicua en las interfaces célula-célula y célula-medio y, por lo tanto, anular la regulación específica de la interfaz de las tensiones corticales. La regulación de la tensión superficial de los tejidos puede convertirse en una herramienta eficaz en la ingeniería de tejidos.

La autoorganización de los tejidos, como la segregación de tipos de células en función de sus propiedades biomecánicas, es un componente importante del desarrollo embrionario en los metazoos1,2,3. Ejemplos bien caracterizados incluyen el desarrollo de las yemas de las extremidades del polluelo4,5, la formación de blastocistos de ratón6,7,8 así como la gastrulación y la formación de la capa germinal en los embriones de pez cebra y Xenopus9,10,11,12. Los campos emergentes de la ingeniería de tejidos y la biofabricación13 también pueden explotar los mecanismos (descubiertos) de autoorganización.

A largo plazo, los tejidos se comportan como fluidos viscosos caracterizados por una tensión superficial tisular específica (TST), como manifestación de la cohesión, que está determinada por la adhesión celular y la tensión cortical celular. Las contribuciones relativas de la adhesión y la tensión cortical a la TT se abordan mediante dos hipótesis: la hipótesis de la adhesión diferencial (DAH)4,14,15 y la hipótesis de la tensión interfacial diferencial (DITH)16. Las diferencias específicas en la TST se consideran contribuyentes importantes a la segregación/clasificación de células in vitro e in vivo y a la estratificación de tejidos en el desarrollo, aunque otros mecanismos como la migración celular colectiva17,18 y la polarización10 u osmolaridad19 claramente desempeñan papeles cruciales.

En el curso de la segregación in vitro de diferentes tipos de células, el tipo de célula caracterizado por una TST más alta tiende a segregarse en el interior, envuelto o engullido por células con una TST más baja4,12,14,20,21,22. Para generar una TST alta, la tensión interfacial célula-medio, formada únicamente por tensión cortical celular, debe aumentarse, mientras que la tensión interfacial célula-célula debe disminuirse, ya que la TST depende de la relación entre la interfaz célula-medio y la interfase célula-medio. tensiones de la interfaz celular. La tensión interfacial célula-célula se compone principalmente de tensión cortical generada por la contracción de actomiosina, mientras que la contribución (negativa) de la tensión de adhesión es baja; por lo tanto, reducir la tensión interfacial célula-célula requiere una reducción activa de la tensión cortical local23.

Se observó agotamiento de miosina 2 no muscular (NM2) en las interfaces célula-célula concomitante con NM2 aparente y acumulación de actina en la interfaz célula-medio en progenitores de la capa germinal in vitro e in vivo21,23. Se demostró que la tensión mecánica cortical promueve la localización cortical de NM2 en embriones de Drosophila y el propio NM2 actúa como un mecanosensor en este proceso de reclutamiento24,25. La regulación diferencial de la tensión cortical específica de la interfaz es un componente crucial de la generación de TST y se cree que está dirigida por señales de los complejos de adhesión célula-célula al citoesqueleto26. Esta vía de señalización comienza a partir de moléculas de adhesión de cadherina que se unen con cadherinas de otra célula en contacto y reclutan cateninas intracelulares para formar un complejo. Entre otros, aquí se recluta y activa p120-catenina (catenina-delta1), por lo que inhibe RhoA, lo que lleva a la inactivación de la Rho quinasa y a una mayor inhibición posterior de la contractilidad de la actomiosina27,28,29,30,31.

Todos los componentes del citoesqueleto contribuyen a las propiedades biomecánicas de las células, pero el citoesqueleto de actomiosina tiene una importancia excepcional. Si bien la red de actina cortical es indispensable para la generación de tensión cortical32, los principales actores en el proceso son las proteínas motoras de miosina. Las interacciones moleculares reveladas en diferentes sistemas experimentales subrayan la importancia de la regulación local de la actividad de la miosina en el desarrollo de las características biomecánicas necesarias para la autoorganización de los tejidos.

Motivados por estudios anteriores sobre el papel del citoesqueleto de actomiosina en la regulación de la tensión superficial del tejido y la segregación21,23, ampliamos estos estudios a una gama más amplia de tipos de células de vertebrados y desarrollamos un análisis cuantitativo de la dinámica de la segregación.

En este artículo utilizamos diferentes tipos de células de tejido de vertebrados y células progenitoras de la capa germinal de pez cebra como modelos in vitro de segregación heterotípica tridimensional para estudiar cómo las perturbaciones del sistema contráctil de actomiosina influyen en la generación de tensión superficial del tejido, la dinámica de agregación y segregación, así como la geometría de dominios homotípicos segregados. Mostramos que la inhibición farmacológica general de la contractilidad de la actomiosina por el inhibidor de la Rho quinasa (ROCK) Y27632 ralentiza la segregación de todos los tipos de células probadas sin afectar la configuración espacial básica de los dominios segregados. También mostramos que la inhibición específica del tipo celular de la actividad de la miosina 2 no muscular mediante la sobreexpresión de la proteína inhibidora del ensamblaje de miosina S100A4 disminuye la tensión superficial del tejido, que se manifiesta en una agregación defectuosa y una posición de segregación invertida. Al expresar ROCK constitutivamente activo en células del ectodermo del pez cebra para activar constantemente la contractilidad de la actomiosina en las interfaces célula-célula y célula-medio, demostramos que anular la regulación específica de la interfaz de la tensión cortical y, por lo tanto, prevenir la reducción local de la tensión de la interfaz célula-célula dará como resultado formación de contacto defectuosa. Además, dicha anulación conduce a una disminución de la tensión superficial del tejido, que se manifiesta en una compactación reducida y una configuración de segregación invertida, lo que subraya el papel de ROCK en la regulación negativa específica de la interfaz de la tensión cortical para la formación de un contacto celular eficaz.

La formación de contactos celulares es el proceso básico que subyace a la agregación y segregación multicelular. Para caracterizar la formación y adhesión de contactos homotípicos, utilizamos el ensayo de aspiración con pipeta dual (DPA) para medir la fuerza del acoplamiento mecánico en las células que forman contactos. Separamos mecánicamente dobletes de células homotípicas formadas en suspensiones celulares de dos tipos de células modelo: queratinocitos primarios de pez dorado (PFK) o línea celular de queratinocitos de pez EPC, y medimos las fuerzas de separación correspondientes. La formación de dobletes homotípicos se limitó a un tiempo de contacto de 1 min y posteriormente se logró una separación celular rápida (t <1 s), dejando poco tiempo para cualquier reorganización del contacto célula-célula, por lo que la medición se describe mejor como la separación de dos sólidos elásticos. Descubrimos que los dobletes homotípicos de células PFK se caracterizaban por una fuerza de contacto mucho mayor manifestada en fuerzas de separación (Fs) más altas que los dobletes de EPC (Fig. 1a). Las formas de contacto también fueron diferentes ya que se observó que los dobletes PFK tenían ángulos de contacto mayores (45,1o, SEM = 0,71) que los dobletes EPC (35,5o, SEM = 0,65), en armonía con las diferencias en la fuerza de contacto (Fig. 1b, c, Películas complementarias 1 y 2).

a Fuerzas de separación Fs de dobletes de queratinocitos primarios de pez dorado (PFK) (n = 13) y dobletes de queratinocitos EPC (n = 17) medidas después de 1 minuto de formación de contacto, los valores medianos están resaltados con líneas azules y amarillas, el asterisco (*) indica estadísticamente significativo diferencia con la prueba t de Student, p < 0,05. b, c Imágenes representativas de dobletes PFK (b) o dobletes EPC (c) sostenidos con una pipeta durante la formación de contacto. Tenga en cuenta la diferencia en los ángulos de contacto resaltados por líneas azules o amarillas como guía para la vista. Barra de escala: 20 µm.

La segregación (o clasificación) de dos tipos de células y la formación de dominios celulares homotípicos 3D a partir de una mezcla uniforme de un número aproximadamente igual de células es un proceso autoorganizado controlado principalmente por la formación de contacto y la cohesión de las células, y la tensión superficial del tejido resultante que caracteriza los tipos de células dados. Para observar el proceso básico de segregación y el posicionamiento espacial final de los dominios segregados, seleccionamos tres pares de tipos de células, principalmente sobre la base de datos anteriores sobre sus fuerzas de contacto de adhesión homotípica. Primero, los queratinocitos primarios de pez dorado (PFK) y los queratinocitos de pez EPC, caracterizados por fuerzas de contacto homotípicas marcadamente diferentes (Fig. 1a), se mezclaron en suspensiones en pozos de cámara de agregación no adherentes donde solo se produce adhesión célula-célula y no adhesión célula-sustrato. . Después de mezclar, observamos el proceso de segregación mediante videomicroscopía fluorescente de lapso de tiempo y registramos la serie de imágenes de agregados individuales (n> 30) durante varias horas hasta que se alcanzaron las configuraciones espaciales finales de los dominios segregados. En todos los experimentos, las células PFK se segregaron dentro del agregado esferoide emergente, mientras que las células EPC formaron el dominio externo (Fig. 2a, Película complementaria 3). A continuación, probamos células de carcinoma epitelial humano A431 y células de fibrosarcoma humano HT1080 en mezclas y observamos su segregación en agregados (n > 20) hasta alcanzar las configuraciones espaciales finales de dominios homotípicos. La dinámica de segregación fue más lenta que la observada para los queratinocitos de peces PFK + EPC; sin embargo, las células epiteliales A431 siempre se segregaron en el interior y las células HT1080 formaron la capa exterior envolvente de esferoides (Fig. 2b, Película complementaria 4). Finalmente, utilizamos células progenitoras de pez cebra (Danio rerio), disociadas del ectodermo o mesodermo inducido, para experimentos de segregación básica. Se tomaron imágenes de agregados (n> 30) de células mixtas de ectodermo y mesodermo durante varias horas y, finalmente, las células del ectodermo se segregaron hacia el interior, mientras que las células del mesodermo hacia el exterior (Fig. 2c, Película complementaria 5), ​​de acuerdo con las expectativas basadas en datos anteriores que muestran Fuerzas de contacto homotípicas más altas para las células del ectodermo en comparación con las células del mesodermo, medidas después de varios minutos de tiempo de contacto23,33.

Imágenes epifluorescentes representativas de series de imágenes de experimentos de segregación. a Segregación de queratinocitos primarios de pez dorado (PFK, rojo) y queratinocitos de pez EPC (EPC, verde). b Segregación 3D de células de carcinoma epitelial humano A431 (A431, rojo) y fibrosarcoma humano HT1080 (HT1080, verde). c Segregación de células del ectodermo (rojo) y del mesodermo (verde) del pez cebra. Los paneles de la izquierda en (a – c) muestran la fase inicial de segregación y los paneles de la derecha muestran la configuración espacial final de los dominios homotípicos segregados. El tiempo después de la mezcla inicial de suspensiones de células heterotípicas se indica en las esquinas inferiores derechas, barras de escala: 100 µm. Consulte también las Películas complementarias 3 a 5.

La clasificación de células es análoga al ordenamiento de fases (desmezclado) en fluidos viscosos20, donde el proceso es impulsado por diferencias en las tensiones superficiales de los componentes fluidos que no se mezclan. La agregación y segregación multicelular están impulsadas por la tensión superficial del tejido, influenciada por la tensión cortical de las células resultante de la actividad citoesquelética, principalmente la contractilidad de la actomiosina.

Primero, para proporcionar un análisis cuantitativo de la dinámica de segregación, desarrollamos herramientas de análisis para medir el tamaño de la formación de grupos de células homotípicas durante la segregación 3D de los tipos de células modelo. Utilizando microscopía de iluminación estructurada, creamos series z de secciones ópticas fluorescentes a través de agregados de esferoides multicelulares donde los tipos de células se visualizaron e identificaron selectivamente por su respectivo color fluorescente. Utilizamos estas secciones ópticas 2D tomadas con una resolución del eje z de 10 micrones, que corresponden aproximadamente al tamaño de la célula, para reconstruir estructuras 3D de los grupos de células segregantes y medir el tamaño de los grupos 3D emergentes de los tipos de células identificados. Los tamaños de los grupos se calcularon sobre la base del método de correlación de dos puntos aplicado dentro y entre las secciones 2D y que arrojaron datos de longitud característicos (ver detalles en Métodos). El corte óptico se realizó de forma consecutiva, lo que produjo series temporales de datos del tamaño de los grupos y vídeos de lapso de tiempo de las estructuras 3D reconstruidas. Después de la mezcla inicial, a medida que los dominios celulares homotípicos se fusionan y fusionan continuamente, vemos un aumento característico en el tamaño promedio de los grupos hasta que se alcanza la configuración espacial final dentro de diferentes duraciones específicas para cada par de tipos de células. Posteriormente, los tamaños de los grupos tienden a alcanzar una meseta (Fig. 3a, c, e: paneles de la izquierda).

Análisis cuantitativo de tamaños de dominios celulares homotípicos segregantes. a Crecimiento dependiente del tiempo de dominios celulares segregados en suspensiones mixtas de queratinocitos PKF y EPC no tratados (panel izquierdo, n = 7) o tratados con inhibidor de ROCK Y27632 100 µM (panel derecho, n = 4). b Imágenes representativas de reconstrucción en 3D de videos de lapso de tiempo de grupos segregantes de queratinocitos PFK (rojo) y EPC (verde) después de 6 h de segregación en ausencia (panel izquierdo) o presencia (panel derecho) de inhibidor de ROCK; consulte la película complementaria 6. c Análisis de tamaños de grupos de células segregadas en mezclas de queratinocitos A431 y fibrosarcoma HT1080 sin (izquierda, n = 6) o con inhibidor Y27632 50 µM (derecha, n = 6). d Imágenes representativas de la segregación de A431 (rojo) y HT1080 (verde) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de inhibidor después de 24 h de segregación; consulte la película complementaria 7. e Análisis de grupos segregados en mezclas de ectodermo y mesodermo de pez cebra sin ( izquierda, n = 8) o con 100 µM Y27632 (derecha, n = 6). f Imágenes representativas de la segregación de ectodermo (rojo) y mesodermo (verde) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de inhibidor después de 15 h de segregación, consulte la película complementaria 8. Las franjas de error representan SEM en (a, c, e). El tiempo después de la mezcla inicial de suspensiones de células heterotípicas se indica en las esquinas inferiores derechas en (b, d, f), barras de escala: 100 µm. Consulte también la figura complementaria 1.

A continuación, interferimos con la contractilidad de la actomiosina tratando las mezclas de células segregantes con Y27632, un inhibidor farmacológico selectivo de la Rho quinasa (ROCK), el principal activador de la función contráctil de NM2. Para los diferentes pares de tipos de células utilizamos diferentes concentraciones de inhibidor que oscilan entre 50 y 100 µM, según datos anteriores34. Como se esperaba, la inhibición general de ROCK conduce a una segregación retrasada, caracterizada por tasas más bajas de crecimiento del tamaño del grupo para los tres pares de tipos de células modelo, que muestran diferentes sensibilidades a la inhibición (Fig. 3a, c, e: paneles de la derecha). Sin embargo, la configuración espacial final de los dominios homotípicos emergentes fue similar a las observadas en experimentos de segregación no tratados. Los tipos de células que normalmente se segregan en el interior todavía tendían a tomar las posiciones internas bajo la inhibición de ROCA, mientras que la fusión de los grupos internos emergentes en un solo grupo central generalmente no ocurrió dentro del marco de tiempo normal (Fig. 3b, d, f, Fig. 1 complementaria). Películas complementarias 6–8).

La agregación celular en suspensión y la formación de agregados esferoides dependen de la tensión cortical de las células generada por la contractilidad de la actomiosina cuando los filamentos de actina son estirados y tirados por minifilamentos bipolares de miosina 2 no muscular. Esto requiere, entre otras cosas, el autoensamblaje de NM2 en minifilamentos. ya que NM2 solo o incluso en estado dimérico no puede mover los filamentos de actina. La multimerización de NM2A, una isoforma de NM2, puede regularse mediante la unión de la proteína S100A435, evitando el ensamblaje de NM2 en multímeros funcionales o facilitando el desensamblaje de filamentos existentes, controlando así la contractilidad celular.

Para inhibir la función contráctil de actomiosina de una manera específica del tipo de célula, utilizamos células A431 que se sabe que expresan la isoforma NM2A36. Sobreexpresamos S100A4 de tipo salvaje en un subclon de células A431 (denominado A431-S100A4). A modo de comparación, sobreexpresamos una isoforma mutante truncada inactiva de S100A4 (MutS100A4), que no provocó ningún efecto sobre el ensamblaje de NM2, en otro subclon de A431 (denominado A431-ctrl) utilizado como control negativo34. Las transferencias Western indican una expresión estable de las variantes S100A4 de tipo salvaje o mutante en los subclones A431 (Figura complementaria 2).

Utilizamos estos subclones A431 para estudiar el efecto de la disminución de la contractilidad de la actomiosina sobre la agregación celular. Colocamos suspensiones de un número igual de células de cada subclon A431 por separado en pocillos de cámara de agregación no adherentes y observamos la formación de agregados de esferoides mediante videomicroscopía de lapso de tiempo (Película complementaria 9, Figura complementaria 3). Para el análisis cuantitativo de agregación, medimos el perímetro de los esferoides como el perímetro de su proyección 2D en la serie de imágenes (Fig. 4). En el caso de las células A431-ctrl (control negativo), la agregación se desarrolló normalmente, caracterizándose por perímetros decrecientes, produciendo esferas redondas con superficie lisa como los esferoides normales de las células A431. En contraste, las células A431-S100A4 con contractilidad reducida se quedaron atrás en la compactación durante todo el proceso de agregación, produciendo esferoides menos compactos y más grandes, caracterizados por perímetros promedio más altos y una superficie rugosa similar a una baya, un fenotipo conocido que indica una disminución de la tensión superficial del tejido37,38.

Análisis cuantitativo de agregación de células A431. a Disminución dependiente del tiempo en el perímetro medio de esferoides que se agregan a partir de una suspensión de células homotípicas de células A431 que sobreexpresan el inhibidor del ensamblaje de NM2 S100A4 (A431-S100A4, n = 10) o su isoforma mutante inactiva (A431-ctrl, n = 10). Las franjas de error representan SEM, el asterisco (*) en t = 24 h indica una diferencia estadísticamente significativa con la prueba t de Student, p <0,01. b Imágenes representativas de contraste de fase de videos de lapso de tiempo de esferoides de células A431-ctrl (panel izquierdo) o células A431-S100A4 (panel derecho) después de 24 h de agregación desde la suspensión. Observe la diferencia en la rugosidad de la superficie del esferoide. Barra de escala: 100 µm. Consulte también la película complementaria 9 y la figura complementaria 3. c, d Representaciones esquemáticas de células de la superficie que resaltan los componentes citoesqueléticos involucrados en la generación de tensión cortical. c Células normales con compactación multicelular efectiva caracterizada por un gran ángulo de contacto Θ debido a la red de actomiosina contraída en la superficie del medio celular y la actomiosina relajada en la interfaz célula-célula acoplada por cadherinas. El ensamblaje de monómeros NM2 en filamentos está controlado por niveles normales de S100A4; los procesos de ensamblaje y desensamblaje están simbolizados por la flecha de doble punta. d Los niveles experimentalmente aumentados de S100A4 conducen al secuestro de monómeros NM2 y a un cambio hacia el desmontaje de filamentos, lo que se supone que resulta en un cambio hacia una reducción de la tensión de actomiosina cortical y una reducción de la compactación multicelular. Las definiciones de los símbolos se muestran en el cuadro de texto central.

Durante la segregación 3D de células en mezclas de células heterotípicas, los dominios homotípicos se forman y crecen por fusión, y la dinámica está influenciada por la tensión superficial del tejido (TST) característica de los tipos de células individuales, que depende de la tensión cortical de las células generada por la contractilidad de la actomiosina. El posicionamiento espacial emergente o la geometría de los dominios homotípicos también depende de la TST, ya que el tipo de célula caracterizado por una TST más alta toma gradualmente posiciones internas, mientras que el otro caracterizado por una TST más baja tiende a permanecer en posiciones externas. Por lo tanto, el posicionamiento espacial es indicativo de la TST de los tipos de células segregantes entre sí. Para estudiar cómo la contractilidad de la actomiosina influye en la tensión superficial del tejido y, finalmente, en el posicionamiento espacial durante la segregación, comparamos el proceso de segregación en dos mezclas de pares de tipos de células diferentes en pocillos de agregación no adherentes. Se mezclaron células de fibrosarcoma HT1080 marcadas con fluorescencia roja con células A431-ctrl que sobreexpresan el mutante inactivo S100A4 o con células A431-S100A4 que sobreexpresan S100A4, que inhibe la contractilidad celular al prevenir el ensamblaje de NM2. Ambos subclones de A431 expresan GFP para visualización fluorescente verde. Observamos la segregación 3D dentro de los agregados de esferoides emergentes mediante microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo y recopilamos series z de secciones ópticas de los grupos de células homotípicas en formación, identificadas específicamente por su color fluorescente. Utilizamos estas secciones ópticas para medir el tamaño promedio de los grupos y reconstruir la estructura 3D para seguir el posicionamiento espacial de los dominios emergentes. Junto con el corte óptico, también tomamos series de imágenes epifluorescentes convencionales utilizadas para una visualización comparable (Películas complementarias 10 y 11). Como se esperaba de las diferencias en la dinámica de agregación de los subclones del carcinoma epitelial A431 con diferentes características de contractilidad celular (Fig. 4), su segregación de las células de fibrosarcoma HT1080 también fue marcadamente diferente. Las células A431 que expresan el mutante inactivo S100A4 (A431-ctrl) se segregaron en el interior de los esferoides, mientras que las células HT1080 tendieron a permanecer afuera (Fig. 5a, b), con una dinámica de crecimiento de grupos y una configuración de dominios homotípicos similares a las observadas para la segregación de A431 normal. y células HT1080 (Fig. 3d, Fig. 2b). Como marcado contraste, la configuración espacial de los dominios segregados se invirtió en el caso de las células A431 que expresaban S100A4 de tipo salvaje (A431-S100A4), ya que estas células mostraron una dinámica de crecimiento de grupos más lenta y finalmente se segregaron hacia el exterior de los esferoides, mientras que las células HT1080 esta vez tendieron a para tomar las posiciones internas (Fig. 5c, d). Este posicionamiento espacial invertido de los dominios homotípicos indica que la inhibición estable de la contractilidad de la actomiosina en las células A431-S100A4 finalmente redujo la tensión superficial específica de su tejido por debajo de la de las células HT1080 (Figura complementaria 4).

a Crecimiento dependiente del tiempo de dominios celulares segregados en suspensiones mixtas de queratinocitos A431 que sobreexpresan células de fibrosarcoma mutantes inactivas S100A4 (A431-ctrl) y HT1080 (n = 6). b Imágenes representativas de reconstrucción 3D (panel izquierdo) y epifluorescencia simultánea (panel derecho, vista inferior) de videos de lapso de tiempo de grupos segregantes de células A431-ctrl (verde) y HT1080 (rojas) después de 40 h de segregación; consulte la película complementaria 10. c Crecimiento dependiente del tiempo de dominios segregados en mezclas de queratinocitos A431 que sobreexpresan el inhibidor del ensamblaje de NM2 S100A4 (A431-S100A4) y células de fibrosarcoma HT1080 (n = 6). d Imágenes representativas de reconstrucción 3D (panel izquierdo) y epifluorescentes (panel derecho, vista inferior) de grupos segregantes de células A431-S100A4 (verde) y HT1080 (roja) después de 40 h de segregación; consulte la película complementaria 11. Tenga en cuenta la configuración invertida de dominios segregados aquí, en comparación con (b). Barra de escala: 100 µm en (b, d). Las franjas de error representan SEM en (a, c). Véase también la figura complementaria 4.

La fuerza de contacto en el acoplamiento de células se puede caracterizar por la fuerza de separación (Fs) medible experimentalmente de los dobletes de células y su ángulo de contacto (Fig. 1).

La tensión de la corteza celular, generada por la contractilidad de la actomiosina cortical, desempeña un papel importante en la formación y expansión del contacto y se demostró anteriormente que se requiere una tensión cortical reducida en la interfaz célula-célula en comparación con la interfaz célula-medio para una expansión de contacto efectiva23. Para estudiar el papel de esta sintonización localizada de la tensión cortical en la formación de contactos, interferimos con la regulación de la contractilidad de la actomiosina de las células. Para facilitar la interpretación de nuestros experimentos, compilamos una figura esquemática que resume: (i) el conocimiento actual sobre la regulación del citoesqueleto por moléculas de adhesión celular, (ii) los principales componentes físicos que generan la tensión superficial del tejido tal como se la conoce actualmente2,3,23, y (iii) las consecuencias esperadas de nuestras intervenciones experimentales en la regulación de la contractilidad celular (Fig. 6).

a Señalización de las moléculas de adhesión celular al citoesqueleto. La transunión de cadherinas de la superficie celular de las células en contacto da como resultado una disminución de la contractilidad de la actomiosina y la tensión cortical en la interfaz célula-célula (Tcc). Las flechas verdes indican activación y el símbolo rojo representa inhibición. En la Discusión se incluye una descripción detallada de esta cascada de señalización y referencias. b Resumen de la generación de tensión superficial del tejido (TST) por células en un agregado, que se muestra como una representación esquemática habitual. La tensión cortical celular en la interfaz célula-medio (Tcm) y la tensión de adhesión (Acc) contribuyen positivamente a la TST, mientras que la tensión cortical en la interfaz célula-célula (Tcc) tiene una contribución negativa. Las tensiones están representadas por flechas. Un ángulo de contacto Θ se indica mediante líneas de puntos como guía para el ojo. c, d Imágenes esquemáticas de agregados celulares con componentes clave de la regulación de la tensión cortical resaltados por símbolos para explicar las intervenciones experimentales. c Células normales en la superficie del agregado que muestran una compactación multicelular efectiva caracterizada por un gran ángulo de contacto Θ debido a una red de actomiosina relajada en la interfaz célula-célula y una baja tensión cortical como resultado de la señalización de las cadherinas transunidas. d Células manipuladas genéticamente que expresan la isoforma ROCK constitutivamente activa, que se espera que active constantemente la contractilidad de la actomiosina en la interfaz célula-célula independientemente de la ROCK endógena inactiva aquí. El impacto propuesto es que caROCK mantiene una mayor tensión cortical en la interfaz célula-célula, lo que lleva a una TST reducida y una compactación menos efectiva caracterizada por un ángulo de contacto más pequeño. Las definiciones de los símbolos se muestran en el cuadro de texto central.

Para un tipo de célula modelo, elegimos células de ectodermo de pez cebra caracterizadas por una alta fuerza de separación (Fs) y un alto ángulo de contacto en los dobletes celulares23, así como una posición de segregación en el interior cuando se mezclan con células de mesodermo, lo que indica una mayor tensión superficial del tejido para el ectodermo (Fig. 2c, Fig. .3f). Usando un ARNm de caROCK microinyectado en embriones de pez cebra inducidos a producir células de ectodermo (ver Métodos para más detalles), sobreexpresamos una isoforma de ROCK constitutivamente activa, que activa constantemente la miosina 2 no muscular (ectodermo-caROCK). Para un control negativo comparable, utilizamos células de ectodermo normales disociadas de embriones inducidos por ectodermo (ectodermo-ctrl).

Primero, medimos el ángulo de contacto Θ de los dobletes de células homotípicas formados aleatoriamente en suspensiones de células ectodermo-caROCK sobre un sustrato no adherente en 30 minutos y los comparamos con los dobletes de células ectodermo-ctrl formados en condiciones similares. La sobreexpresión de caROCK disminuyó significativamente el ángulo de contacto, según lo respalda la prueba t de Student (p <0,001) realizada en datos de doblete celular (Fig. 7).

a Imagen esquemática de un doblete de células homotípicas después de la formación de contacto. El ángulo de contacto Θ se indica mediante líneas que sirven de guía para el ojo. b Análisis cuantitativo de los ángulos de contacto de dobletes homotípicos de células de ectodermo no tratadas (ectodermo-ctrl, n = 170) o células de ectodermo que sobreexpresan ROCK constitutivamente activo (ectodermo-caROCK, n = 210). Los ángulos de contacto se midieron después de 30 minutos de formación de contacto. Los valores medianos están resaltados por líneas rojas y azules, el asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa con la prueba t de Student, p < 0,001. c, d Imágenes representativas de contraste de fase de dobletes de células homotípicas que se adhieren libremente en suspensiones de ectodermo-ctrl (c) o ectodermo-caROCK (d) después de 30 minutos. Tenga en cuenta la diferencia entre (c) y (d) en los ángulos de contacto resaltados por líneas amarillas como guía para el ojo. Los números son identificaciones de ángulos de contacto para su análisis. Barra de escala: 20 µm.

A continuación, estudiamos la dinámica de agregación de las células ectodermicas que expresan caROCK comparándolas con las células ectodermicas-ctrl. Colocamos suspensiones de células homotípicas separadas de un número aproximadamente igual de células de estos dos tipos de células en pocillos de la cámara de agregación no adherentes y tomamos imágenes de su agregación en esferoides mediante videomicroscopía de lapso de tiempo (Película complementaria 12). Para el análisis cuantitativo, durante todo el proceso de agregación, medimos el perímetro de la proyección 2D de esferoides en la serie de imágenes y normalizamos los datos del perímetro dependientes del tiempo con el perímetro inicial de cada esferoide. Para las células ectodermo-ctrl normales, los perímetros promedio de los esferoides disminuyeron, lo que resultó en esferoides compactos con superficies lisas. Por el contrario, la agregación ectodermo-caROCK fue más lenta, lo que resultó en esferoides menos compactos caracterizados por perímetros más altos y superficies rugosas similares a bayas, una indicación de una disminución de la tensión superficial del tejido que caracteriza a estas células (Fig. 8a, b).

Análisis cuantitativo de la agregación de células del ectodermo del pez cebra. a Disminución dependiente del tiempo en el perímetro medio de esferoides que se agregan a partir de suspensiones de células homotípicas de células de ectodermo no tratadas (ectodermo-ctr, n = 20) o de células de ectodermo que sobreexpresan ROCK constitutivamente activo (ectodermo-caROCK, n = 20). Los perímetros de los esferoides se normalizan y se representan como porcentaje de los perímetros iniciales, las franjas de error representan SEM, el asterisco (*) en t = 10 h indica una diferencia estadísticamente significativa con la prueba t de Student, p <0,01. b Imágenes representativas de contraste de fase de videos de lapso de tiempo de esferoides de células ectodermo-ctrl (panel izquierdo) o células ectodermo-caROCK (panel derecho) después de 10 h de agregación. Observe la diferencia en la rugosidad de la superficie del esferoide. Barra de escala: 100 µm. Consulte también la película complementaria 12. c – f Detección por inmunofluorescencia de la cadena ligera de fosfomiosina (p-MLC) en esferoides de células de ectodermo. c, d Esferoide Ectoderm-ctrl con solo etiquetado p-MLC (c) o imagen fusionada de etiquetas p-MLC (amarillo) y NucBlue (azul). e, f Un esferoide de células ectodermo-caROCK marcadas para p-MLC (e) o imagen fusionada de la etiqueta p-MLC (amarilla) y la tinción NucBlue (azul). Los núcleos celulares se visualizan mediante tinción con NucBlue. Tenga en cuenta que la señal de inmunofluorescencia de p-MLC apenas se ve en (c), mientras que es mucho más pronunciada después de la introducción de caROCK en (e). Barra de escala: 10 µm en c–f.

Para verificar el efecto de la sobreexpresión de caROCK sobre la actividad de la miosina, utilizamos estos esferoides para inmunodetectar la forma fosforilada de la proteína de la cadena ligera reguladora de la miosina (MLC). MLC es fosforilado principalmente por ROCK, por lo que NM2 se convierte en su estado activo, lo que le permite ensamblarse en filamentos y eventualmente mover filamentos de actina de acuerdo con el ciclo funcional de Lymn-Taylor del complejo de actomiosina. Por lo tanto, el nivel y la localización subcelular de fosfo-MLC es indicativo de la contractilidad de la actomiosina. En comparación con las células ectodermo-ctrl, las células ectodermo-caROCK mostraron niveles de inmunodetección de p-MLC considerablemente mayores en todos los agregados, incluida la región en masa, lo que indica una mayor contractilidad de actomiosina allí (Fig. 8c-f).

La configuración espacial de los dominios celulares homotípicos formados en el curso de la segregación 3D en mezclas de células heterotípicas es indicativa de las tensiones superficiales del tejido que caracterizan los tipos celulares específicos. La formación de contacto célula-célula requiere una reducción localizada de la tensión cortical en la interfaz célula-célula, lo que puede lograrse mediante la inhibición localizada de la contractilidad de la actomiosina, una hipótesis que pretendíamos probar.

Para estudiar el papel de la inhibición localizada de la contractilidad de la actomiosina en las interfaces célula-célula, utilizamos células de ectodermo de pez cebra que sobreexpresan una isoforma de ROCK constitutivamente activa (ectodermo-caROCK), anulando dicha inhibición localizada. Las células Ectoderm-caROCK se caracterizan por propiedades de agregación disminuidas y tensión superficial del tejido reducida, en comparación con las células ectoderm-ctrl normales (Fig. 8).

Mezclamos células de mesodermo de pez cebra en cantidades iguales con células de ectodermo-ctrl o células de ectodermo-caROCK en pocillos de agregación no adherentes y observamos su segregación mediante microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo combinada con microscopía de epifluorescencia convencional (Películas complementarias 13 y 14). A lo largo del proceso de segregación, recopilamos series z de secciones ópticas de los grupos de células homotípicas específicamente identificadas para medir el tamaño de los grupos y para reconstruir la estructura 3D que revela la configuración espacial de los dominios homotípicos emergentes.

Las células ectodermo-ctrl se segregaron en el interior de los esferoides dejando grupos de células de mesodermo en posiciones externas (Fig. 9b), mientras que la dinámica de crecimiento de los grupos y la configuración espacial fueron similares a otras pruebas con estos tipos de células (Fig. 2c, Fig. 3e). Como marcado contraste, la configuración de segregación de las células ectodermo-caROCK con células mesodermo se invirtió (Fig. 9d). Las células del mesodermo ahora tendían a segregarse hacia el interior de los esferoides con una dinámica normal de crecimiento de los grupos de células, mientras que la tasa de crecimiento del grupo de ectodermo-caROCK se redujo constantemente (Fig. 9c) y los grupos de ectodermo-caROCK se segregaron hacia el exterior como una indicación de una disminución de la superficie del tejido. tensión (Figura complementaria 5). Esto es consistente con la disminución de la tensión superficial del tejido observada para las células ectodermo-caROCK en agregación (Fig. 8) y respalda la afirmación de que el ROCK constitutivamente activo previene la inhibición local de la contractilidad de la actomiosina en la interfaz célula-célula que normalmente se requiere para la formación de un contacto efectivo y expansión y eventualmente generación de alta tensión superficial del tejido.

a Aumento dependiente del tiempo en el tamaño medio de los grupos de células segregadas en agregados (n = 16) que se forman en suspensiones mixtas de células de ectodermo de pez cebra normales (ectodermo-ctrl) y células de mesodermo. b Reconstrucción 3D representativa (panel izquierdo) e imágenes epifluorescentes simultáneas (panel derecho, vista inferior) de videos de lapso de tiempo de grupos segregantes de células ectodermo-ctrl (rojas) y mesodermo (verde) después de 12 h de segregación; consulte la película complementaria 13. c Crecimiento dependiente del tiempo de tamaños de grupos de células segregadas en agregados (n = 15) de células de ectodermo mixtas que sobreexpresan ROCK constitutivamente activo (ectodermo-caROCK) y células de mesodermo. d Imágenes representativas de reconstrucción 3D (izquierda) y epifluorescentes (derecha, vista inferior) de grupos segregantes de células de ectodermo-caROCK (rojo) y mesodermo (verde) después de 12 h de segregación; consulte la película complementaria 14. Tenga en cuenta la configuración espacial invertida de segregados dominios aquí, en comparación con el panel (b). Barra de escala: 100 µm en (b, d). Las franjas de error representan SEM en (a, c). Consulte también la figura complementaria 5.

Los principales mecanismos que actúan mientras un óvulo fertilizado se convierte en un embrión completamente desarrollado aún no se comprenden completamente, pero se puede identificar que algunos de los ingredientes del proceso están dominados por la difusión, la migración colectiva espontánea y la migración como resultado de algunas señales guía. (por ejemplo, gradientes de quimiocinas y/o factores de crecimiento)18. A la luz de las consideraciones anteriores, nos sentimos motivados a investigar dos aspectos del surgimiento de la morfología durante la segregación celular 3D: (i) probamos si las conclusiones de estudios anteriores sobre la formación de patrones de segregación de células progenitoras del pez cebra se aplican a una gama más amplia de vertebrados. células y (ii) aplicamos un análisis computacional a las grabaciones 3D de lapso de tiempo, lo que abre el camino para analizar los roles relativos de los mecanismos de difusión y movimiento grupal durante la segregación.

Las dos modalidades (difusión y movimiento colectivo) dan como resultado dependencias temporales características distintas. Durante la segregación de dos tipos de células de aproximadamente el mismo número, la teoría predice que el tamaño lineal característico de los grupos de células homotípicas crece con el tiempo como ley de potencia según tz con z = 1/3, mientras que el movimiento coherente de las células del mismo El tipo da como resultado un ritmo de segregación mucho más rápido caracterizado por un crecimiento lineal de los diámetros del grupo con z = 1, en consecuencia39. Dado que uno de los focos de nuestro estudio es la dependencia temporal del nivel de segregación, era esencial que analizáramos nuestras configuraciones celulares medidas mediante un método bien establecido tomado de la física estadística y confiando en la determinación de la llamada función de correlación de densidad. Nuestros datos cuantitativos sobre la dinámica de varios modelos in vitro de segregación celular en 3D pueden utilizarse en estudios futuros sobre modelado computacional de segregación en 3D.

La tensión superficial del tejido (TST) es una propiedad biomecánica importante que caracteriza la organización multicelular y es necesaria para la autoorganización del tejido. Estudios anteriores han implicado que se requiere una regulación específica de la interfaz de la tensión cortical para la formación del contacto entre células e implica una reducción activa de la tensión de la corteza en las interfaces entre células. Durante la formación y agregación del contacto celular, la localización de la miosina 2 no muscular (NM2) cambia en las interfaces: se acumula en las interfaces célula-medio, mientras que se agota en las interfaces célula-célula, lo que implica que la regulación de la tensión cortical específica de la interfaz involucra la interfaz. -reclutamiento específico de NM221,23. La fuerza de contacto de dos células en contacto se puede caracterizar mediante la fuerza de separación, que se puede medir experimentalmente ex vivo mediante el ensayo de aspiración con doble pipeta (DPA). Además de la fuerza de separación, el ángulo de contacto que caracteriza a las células en contacto también es indicativo de la fuerza de contacto, ya que ángulos de contacto más altos coinciden con fuerzas de separación más altas. La fuerza del contacto depende de las moléculas de adhesión a la superficie celular, lo que contribuye positivamente y también está limitada por su anclaje al citoesqueleto, mientras que una contribución negativa proviene de la tensión de la corteza celular en el sitio de contacto. La tensión cortical en el contacto se reduce activamente durante la formación de contacto de las células progenitoras de la capa germinal, junto con una reducción de NM2 en el área de contacto23.

Estudios en cultivos epiteliales han revelado mecanismos de regulación a través de los cuales la transunión de cadherina en la interfaz célula-célula inicia la señalización hacia el citoesqueleto26,40. El mecanismo implícito implica el reclutamiento de p120-catenina en complejos de cadherina28, donde p120-catenina inhibe la actividad de RhoA localmente27 mediante el reclutamiento de p190RhoGAP30. La inhibición de RhoA conduce a una mayor inactivación posterior de ROCK y, finalmente, a una regulación negativa de la actividad de NM2. La alfa-catenina contribuye a la unión y las funciones de p120-catenina41 y la importancia de esta interacción está indicada por estudios que muestran que la pérdida de alfa-catenina en agregados de células embrionarias da como resultado una reducción de la tensión superficial del tejido42. La cascada de señalización que comienza a partir de cadherinas transunidas eventualmente regula negativamente la contractilidad de la actomiosina basada en NM2, lo que permite el control local de la tensión cortical (Fig. 6). NM2 también puede actuar como un mecanosensor ya que la tensión mecánica estabiliza su asociación con la actina25,43 y, por lo tanto, el reclutamiento de NM2 en áreas de alta tensión cortical puede proporcionar medios adicionales de regulación específica del sitio del citoesqueleto cortical.

En este estudio, aplicamos varias formas de perturbar la contractilidad de la actomiosina y analizamos la segregación 3D de varios pares de tipos de células modelo como una lectura funcional para estudiar el efecto de tales perturbaciones. Mostramos que la inhibición general de ROCK por el inhibidor permeable a las células Y27632 disminuye la TST y, como resultado, retrasa y ralentiza la segregación; sin embargo, la configuración espacial final de los dominios segregados se ve poco afectada (Fig. 3). Los tipos de células caracterizados por una TST alta y que se segregan en el interior en condiciones normales continuaron haciéndolo bajo la inhibición general de ROCK, lo que indica que la inhibición de la actividad NM2 en ambos tipos de células segregantes no cambia considerablemente la diferencia entre sus respectivas TST. Esto puede deberse al hecho de que, ante la falta de tensiones corticales considerables basadas en NM2, las diferencias imperturbadas en la tensión de adhesión ahora pueden dominar la generación de TST e impulsar una segregación más lenta. Una interpretación alternativa es que las concentraciones aplicadas del inhibidor de ROCK, aunque se encuentran en el rango alto para los tipos de células estudiados34, pueden permitir diferentes actividades residuales de NM2 específicas del tipo de célula que explican diferentes tensiones corticales que dan como resultado configuraciones de segregación sin cambios.

El análisis cuantitativo de la dinámica de la segregación puede revelar aquí la sensibilidad de la dinámica a la inhibición general de la contractilidad de la actomiosina y esto también puede revelar las diferentes contribuciones de las tensiones corticales y la tensión de adhesión a la generación de TST. La tasa de crecimiento del tamaño del grupo en la segregación de queratinocitos se ve poco afectada por la inhibición de la actomiosina (Fig. 3a), lo que indica una mayor contribución de la adhesión a la generación de TST, en comparación con la segregación de las células A431 y HT1080, donde la inhibición de la contractilidad de la actomiosina ralentiza profundamente la segregación. (Fig. 3c), lo que indica la mayor contribución de las tensiones corticales a la TST. Se necesitarían pruebas adicionales que analicen las contribuciones de la contractilidad de la actomiosina y la tensión de adhesión basada en cadherina a TST31 para interpretar más específicamente este fenómeno, que claramente queda fuera del alcance de este artículo.

Demostramos que la inhibición específica del tipo celular de la contractilidad de la actomiosina mediante la inhibición del ensamblaje de NM2 en filamentos funcionales por parte de S100A4 reduce la TST que caracteriza a ese tipo de célula. Esta reducción se manifiesta en configuraciones de segregación generadas por los dos tipos de células de tejido humano donde las células epiteliales anteriormente ubicadas en el interior ahora se segregan en el exterior debido a su escasez de filamentos NM2 funcionalmente ensamblados (Fig. 5). La inhibición del ensamblaje de NM2 en toda la célula también da como resultado una reducción de la compactación de los agregados de células homotípicas y la falta de células estiradas en la superficie de los esferoides en formación (Fig. 4), lo que indica que la generación de tensión cortical en la interfaz entre la célula y el medio, que es el principal impulso. del proceso de agregación, depende claramente de la estructura funcional de la actomiosina. Tenga en cuenta aquí que S100A4 inhibe solo la isoforma NM2A35, y las diferentes isoformas de NM2 pueden tener funciones distintas en la regulación de la tensión cortical; sin embargo, esto no contradice nuestra conclusión de que la TST se puede reducir inhibiendo el ensamblaje de NM2. Una reducción similar en la TST se demostró anteriormente21 tras la inactivación ubicua de NM2 mediante la expresión de una isoforma ROCK negativa dominante en células del ectodermo del pez cebra, lo que sugiere un mecanismo universal en tipos de células de diversos orígenes.

Finalmente, y lo que es más importante, demostramos que si la regulación específica de la interfaz de la tensión cortical se anula mediante la expresión de un mutante ROCK constitutivamente activo en las células del ectodermo del pez cebra, un tipo de célula normalmente caracterizada por una TST alta y que se segrega en el interior de las células del mesodermo, estas células del ectodermo ahora se segregan. afuera, indicando TST reducida (Fig. 9). La compactación ligeramente retrasada y reducida durante la agregación multicelular de células ectodérmicas que expresan caROCK también es característica junto con la aparición de células redondas ligeramente adheridas en la superficie de estos esferoides, lo que indica una tendencia a la reducción de la TST, mientras que la actividad de NM2, evaluada por inmunofluorescencia, También estaba elevado en todos estos esferoides (Fig. 8). Es importante destacar que cuando se forman dobletes de células de ectodermo homotípicos en cultivo mediante adhesión célula-célula, observamos una tendencia a ángulos de contacto reducidos en los dobletes de células que expresan caROCK (Fig. 7), lo que es una indicación de un aumento de la tensión interfacial célula-célula aquí.

Todas estas observaciones indican que caROCK, que no puede regularse negativamente, activa constantemente NM2 y, por lo tanto, mantiene alta la contractilidad de la actomiosina en todos los sitios de la corteza celular, mientras que la tensión cortical normalmente debería reducirse en la interfaz célula-célula debido a la inactivación de ROCK endógeno por señalización de cadherinas transligadas aquí. Por el contrario, debido a la falta de cadherinas transligadas en la interfaz entre la célula y el medio, el ROCK endógeno no se inactiva allí mediante esta vía de señalización y mantiene alta la contractilidad de la actomiosina, que puede aumentar aún más con caROCK. Porque la TST depende principalmente de la diferencia de tensión cortical en la interfaz célula-medio (Tcm) y de la tensión cortical en la interfaz célula-célula (Tcc) con una contribución menor de la tensión de adhesión célula-célula (Acc) como TST ≈ Tcm-Tcc+ Acc/2 en general2,3,23,42, esta diferencia disminuye en las células que expresan caROCK debido a su menor capacidad para reducir la tensión cortical en la interfaz célula-célula, mientras que no se supone la contribución menor de la tensión de adhesión célula-célula. cambiar (Fig. 6).

Los hallazgos anteriores, en comparación con estudios anteriores21,23, proporcionan en conjunto pruebas experimentales de que la sintonización de la tensión cortical específica de la interfaz a través de la regulación local del sistema contráctil de actomiosina por parte de ROCK determina la TST de las estructuras multicelulares, lo que impulsa su autoorganización, incluida la segregación. . Las intervenciones específicas del tipo de célula en la regulación de la actividad de NM2 o el ensamblaje de NM2 en filamentos funcionales se pueden utilizar como herramientas potenciales para modular la TST y, eventualmente, la autoorganización de los tejidos en los campos emergentes de la ingeniería de tejidos.

El pez cebra (Danio rerio) de tipo salvaje (AB) utilizado en este estudio se mantuvo y crió en las instalaciones pesqueras de la Universidad ELTE Eötvös Loránd de acuerdo con protocolos estándar44,45. Todos los protocolos utilizados en este estudio fueron aprobados por la Oficina Nacional de Seguridad de la Cadena Alimentaria de Hungría (Número de permiso: XIV-I-001/515-4/2012). Los peces de colores (Carassius auratus) utilizados en este estudio se mantuvieron en el Departamento de Física Biológica de la Universidad Eötvös Loránd en condiciones de acuario estándar, aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad.

Los plásmidos pCS2+cyclops, pCS2+lefty1, pCS2+mCherry-H2A, pCS2+EGFP-H2B se utilizaron para producir ARNm para microinyecciones. También se clonó CDS ROCK (ca-ROCK) constitutivamente activo en la columna vertebral de pCS2+ a partir del constructo pCAG-myc-p160∆346, un amable obsequio de Jeffery Amack (Universidad Estatal de Nueva York Upstate Medical University). Los plásmidos se linealizaron con la enzima de restricción KpnI y se transcribieron in vitro con el kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, AM1340) según el protocolo del fabricante.

Los cultivos celulares elaborados a partir de células primarias o líneas celulares disponibles comercialmente se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma D6429) que contenía L-glutamina 4 mM, suplementado con suero fetal de ternera al 10% (FCS, GIBCO) y penicilina-estreptomicina-anfotericina B. (Lonza), en una incubadora humidificada con una atmósfera de CO2 al 5% en placas de 6 pocillos de grado de cultivo de tejidos o placas de cultivo (Greiner) a 37 °C o 25 °C, según el tipo de célula. Los cultivos celulares establecidos a partir de embriones de pez cebra disociados se mantuvieron para experimentos en medio independiente de CO2 (GIBCO) suplementado con FCS al 10% (GIBCO), L-glutamina 4 mM y penicilina-estreptomicina-anfotericina B (Lonza) en una incubadora humidificada a 28°. C.

Los queratinocitos primarios de peces se aislaron de escamas de peces de colores (Carassius auratus) como se describió anteriormente47. Brevemente, sin sacrificar el pez dorado, se aislaron algunas escamas y se mantuvieron en medio de cultivo DMEM-10% FCS durante un día mientras los queratinocitos migraban de las escamas a la placa de cultivo. La línea celular de queratinocitos de pescado EPC se adquirió de ATCC (CRL-2872) y se mantuvo en medio DMEM-10% FCS.

Se prepararon suspensiones celulares a partir de ambos cultivos de queratinocitos después de una breve incubación en PBS (solución salina tamponada con fosfato, fosfato 0,1 M, NaCl al 0,9 %, pH 7,4, GIBCO) y se transfirieron en medio independiente de CO2-FCS al 10 % a 25 °C para experimentos.

La línea celular de carcinoma epitelial humano A431 (CRL-1555) y la línea celular de fibrocarcinoma humano HT1080 (CCL-121) se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en DMEM-10% FCS a 37 °C. Los cultivos en monocapa A431 o HT1080 se incubaron brevemente con 0,5 mg/ml de tripsina y 0,2 mg/ml de EDTA (Sigma) en PBS (GIBCO), luego las células se enjuagaron y transfirieron en suspensiones en un medio de cultivo para experimentos.

Se indujo que los embriones de pez cebra (Danio rerio) consistieran en un solo tipo de célula progenitora de la capa germinal mediante la microinyección de embriones en etapa de 1 célula con ARNm de lefty1 (100 pg) para ectodermo o ARNm de cíclope (100 pg) para mesodermo. El etiquetado fluorescente se logró mediante la coinyección en la etapa de 1 célula con ARNm (200 pg) que codifica histona2A-mCherry, lo que da como resultado núcleos marcados en rojo en el ectodermo o histona2B-EGFP, lo que da como resultado núcleos verdes en el mesodermo. Para crear células ectodérmicas con actividad Rho quinasa alterada, coinyectamos ARNm de lefty1 y EGFP-H2A con ARNm de caROCK (100 pg). Los embriones se mantuvieron en medio L15 (Sigma, L1518) a 28,5 °C hasta la etapa de esfera (4 hpf), luego se disociaron mecánicamente en suspensiones de células individuales en medio independiente de CO2-FCS al 10% a 28 °C para experimentos.

Las células no marcadas se marcaron con tintes fluorescentes para obtener imágenes de microscopía de fluorescencia. Generalmente, todos los tipos de células o líneas celulares se marcaron mediante incubación con los colorantes en condiciones de cultivo monocapa en medio de cultivo DMEM-10% FCS. Los queratinocitos primarios de pez dorado y las células de carcinoma epitelial humano A431 se marcaron con CellTracker Red CMTPX 10 µM (Invitrogen, C34552) durante 90 min o 30 min, respectivamente. Los queratinocitos de pescado EPC y las células de fibrosarcoma humano HT1080 se marcaron con CellTracker Green CMFDA 5 µM (Invitrogen, C7025) durante 90 min o 30 min, respectivamente.

Los agregados de células de ectodermo de pez cebra se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 10 minutos. Los sitios de unión no específicos se bloquearon mediante incubación en un medio de cultivo que contenía suero al 10% durante 2 h. Se aplicó anticuerpo primario contra la cadena ligera de miosina fosforilada (pS19) (conejo, policlonal, Anti-MYL12A fosfo S19, Abcam ab2480) en una dilución 1/100 durante 2 h a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 °C. Se utilizó anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con AlexaFluor-555 (Southern Biotech, 4030-32) en una dilución 1/200 durante 4 h a temperatura ambiente. Todas las incubaciones fueron seguidas por triples pasos de lavado en PBS durante 1 h. Finalmente, los agregados inmunomarcados se montaron en portaobjetos microscópicos (Thermo Scientific) utilizando un medio de montaje (Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Stain, Invitrogen, P36981) que contenía contratinción NucBlue para visualizar los núcleos celulares. Se tomaron imágenes de etiquetas fluorescentes utilizando un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 con objetivos Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0,75 u Olympus A 100x/1,3 y una cámara CCD Zeiss AxioCam MRm. Las imágenes se procesaron utilizando el software NIH ImageJ.

Las cámaras de micropocillos de agregación se fabricaron fundiendo agarosa líquida al 2 % fundida (Invitrogen) en PBS y permitiéndole gelificarse en una forma PDMS negativa (3D Petri Dish, Microtissues) que contenía pilares que definen pocillos no adherentes con un diámetro y una profundidad de 800 µm. . Después de retirarlas de la forma negativa, las cámaras de gel de agarosa se equilibraron con medio de cultivo durante 2 h antes de transferir aproximadamente 3000 células en suspensión a cada micropocillo.

Para inhibir la contractilidad de la actomiosina utilizamos Y27632, el inhibidor celular permeable de la Rho quinasa (ROCK), adquirido de Merck Millipore, disuelto en agua para preparar soluciones madre de 10 mM y utilizado en concentraciones finales que oscilan entre 50 y 100 µM. Para los tratamientos de control negativo, se utilizó una cantidad idéntica de agua.

Para inhibir la formación de filamentos y la función de la miosina 2 A no muscular en células de carcinoma epitelial A431, las transfectamos con construcciones S100A4 humanas. Se prepararon construcciones de ADN que expresaban el tipo salvaje o un mutante inactivo como se describió anteriormente34. La forma mutante (MutS100A4), derivada mediante el método Megaprimer48, carece de 13 aminoácidos en el extremo C-terminal y contiene una mutación puntual en la posición 81 que reemplaza una cisteína por serina, por lo que no inhibe el ensamblaje de NM2. Tanto la secuencia codificante de S100A4 de tipo salvaje como la mutante se subclonaron en el plásmido pIRES2-eGFP (Clontech), que contiene un sitio de entrada al ribosoma interno utilizando los sitios de restricción XhoI y BamHI. Utilizando el sitio de restricción BsaI para la linealización, las células se transfectaron con plásmidos linealizados, utilizando el reactivo de transfección FuGene HD (Promega) según las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron transfectantes estables con 0,4 mg/ml de antibióticos G418 (Merck Millipore). Después de dos semanas de selección en medio suplementado con G418, las células transfectadas de manera estable se seleccionaron adicionalmente por su señal de GFP utilizando FACSAria Cell Sorter (BD Biosciences). Después de la selección, las células se mantuvieron en 0,2 mg/ml de G418. Finalmente se establecieron seis clones celulares que sobreexpresan S100A4 y cinco que sobreexpresan mutS100A4, de los cuales uno de cada grupo se usó para estudios de agregación y segregación.

Los transfectantes estables A431 se lisaron en tampón de lisis celular (Tris 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, DTT 2,5 mM, Triton X-100 al 1% v/v y cóctel de inhibidor de proteasa al 1% v/v). La concentración de proteína se midió mediante el ensayo de Bradford y se procesaron muestras de 20 µg de proteína total en SDS-PAGE usando gel de Tris-Tricina al 10%. Las muestras se transfirieron a una membrana de PVDF, luego se detectó la proteína S100A4 mediante un anticuerpo anti-S100A4 (ratón, monoclonal, PR006.21.3, dilución 1:1000, un amable obsequio del Dr. Jörg Klingelhöfer de la Universidad de Copenhague), seguido de conjugación con peroxidasa de rábano picante. anticuerpo secundario anti-ratón (dilución 1:5000, Santa Cruz). Para el control de carga, la tubulina se detectó mediante un anticuerpo monoclonal anti-tubulina (dilución 1:5000, Sigma) y un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante. La quimioluminiscencia se detectó utilizando sustrato de transferencia Western ECL (Pierce).

La DPA se realizó como se describió en detalle anteriormente23. En resumen, se prepararon suspensiones de células individuales a partir de cultivos monocapa de queratinocitos después de una breve incubación en PBS, luego se lavaron en medio independiente de CO2 (GIBCO) y se sembraron en una placa con fondo de vidrio pasivado (Mattek). Las células se recogieron usando micropipetas preparadas a partir de capilares de vidrio (World Precision Instrument, TW100-3) usando un extractor de microagujas (Sutter Instrument, extractor de micropipetas P-97 Flaming Brown) para producir capilares con un cono de aproximadamente 3,5 µm de radio interno, doblados para Ángulo de 45o (instrumento Microdata, MFG-5) y pasivado con FBS inactivado por calor (Invitrogen).

Las micropipetas se conectaron en dos canales independientes con presión negativa que oscilaba entre 7 y 750 Pa a un sistema de control de flujo de microfluidos (Fluigent, Fluiwell), montado en dos micromanipuladores (Eppendorf, Transferman Nk2) con movimiento de micropipeta y presión controlada mediante un programa personalizado. Interfaz Labview (National Instruments). Para manipulaciones celulares aprox. Se utilizó una presión negativa de 20 Pa.

Después de poner las células en contacto, se dejaron adherir los dobletes durante 1 min. Luego, las células adheridas se agarraron con dos micropipetas (pipetas de sujeción y sonda) en lados opuestos del contacto célula-célula. La micropipeta de sujeción se usó para sujetar firmemente una celda con una presión fija que oscilaba entre 10 y 5000 Pa. La micropipeta de sonda se usó para aplicar presiones crecientes graduales que oscilaban entre 2 y 10 Pa con tamaños de paso entre 0,5 y 3 Pa a la otra celda. Después de cada paso de presión, las micropipetas se separaron a 20 µm/s en un intento de separar las células en contacto. Una vez que la presión aplicada en la pipeta de sonda fue lo suficientemente alta como para separar las células en contacto, la fuerza de separación, Fs, se pudo calcular a partir de la presión final y la presión de la última separación fallida usando Fs = pi R2(Pn − 1 + Pn)/ 2 donde R es el radio de la micropipeta, Pn es la presión aplicada por la pipeta de sonda durante el paso de separación y Pn - 1 es la presión aplicada durante el paso de extracción que precede al paso de separación. El número de pasos de presión se mantuvo normalmente entre 1 y 3.

Se tomaron imágenes de las separaciones celulares en un microscopio invertido Zeiss Axiovert equipado con un objetivo LD PlanNe-oFluar 40x, 0,6 NA Ph2 Korr, una cámara CoolSnap HQ (Photometrics) y una caja de calentamiento ajustada a 28 °C. Los ángulos de contacto del doblete celular se caracterizaron utilizando el software NIH ImageJ.

Las grabaciones de lapso de tiempo con contraste de fase o aplicaciones de fluorescencia doble se realizaron en un microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 con objetivo Zeiss Plan Neofluar 10x, 0,3 NA acoplado a una cámara CCD Zeiss Axiocam MRM y equipado con una platina alimentada por Marzhauser SCAN-IM. Se utilizó el sistema de iluminación LED Zeiss Colibri para la excitación fluorescente. Para la microscopía de iluminación estructurada y el seccionamiento óptico fluorescente utilizamos el módulo Zeiss Apotome. Durante la obtención de imágenes en lapso de tiempo, los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora de etapa superior (CellMovie) que proporcionaba la temperatura y la atmósfera de CO2 requeridas. El posicionamiento de la etapa de potencia, la iluminación, el enfoque, el seccionamiento óptico y la recopilación de imágenes primarias se controlaron mediante el software Zeiss Axiovision 4.8 y un módulo de software de gestión de experimentos personalizado en una PC. Las imágenes se procesaron adicionalmente utilizando el software Zeiss Axiovision 4.8 y NIH ImageJ.

Las imágenes registradas mediante microscopía de lapso de tiempo de contraste de fase se analizaron utilizando el software NIH ImageJ con complementos de nuestro diseño, disponibles en https://github.com/gulyasmarton/ContractilityAnalyzer.git. Para el ensayo de agregación de esferoides, las imágenes fueron preprocesadas por un operador Sobel de detección de bordes y un filtro de desenfoque gaussiano de 5 píxeles de ancho. Las imágenes preprocesadas fueron segmentadas por el umbral predeterminado ImageJ (IsoData49). El ruido de segmentación se redujo rellenando huecos de menos de 1000 píxeles. El esferoide fue identificado como el grupo más grande de píxeles conectados. Repitiendo este procedimiento para cada cuadro de la secuencia de imágenes, calculamos el perímetro del esferoide dependiente del tiempo.

Para caracterizar el tamaño promedio de los grupos en imágenes microscópicas de fluorescencia, se realizó un análisis de longitud de correlación como se describió anteriormente47. Se utilizó la longitud de correlación de correlaciones de dos puntos. Sólo se consideraron los píxeles con intensidades superiores a un umbral.

Primero, determinamos las correlaciones de dos puntos para ambos colores en un rango determinado (0–200 µm) y calculamos el diámetro de los grupos. Para distancias pequeñas, la correlación de dos puntos se puede aproximar como una forma cuadrática de la distancia:

donde R0 denota el diámetro promedio de los racimos y K es un factor que generalmente se desconoce ya que

Depende de la distribución de las formas de los grupos. Al ajustar un polinomio a las correlaciones obtuvimos el tamaño típico de un grupo.

Cuando se realizaron análisis estadísticos, los tamaños de muestra relevantes como el número de entidades independientes analizadas se indican como n números. Cuando se establecen diferencias estadísticamente significativas como resultado de comparar los valores medios de dos conjuntos de datos, se aplicó la prueba t de Student con un entorno no apareado y asumiendo varianzas desiguales. Generalmente, el valor p revelado se refiere a la probabilidad P de dos colas (T <= t).

Para los gráficos que muestran el crecimiento del tamaño del grupo dependiente del tiempo de un tipo de célula particular durante la segregación de otro tipo de célula, los procesos de recopilación y análisis de datos son los siguientes: Las series de imágenes de pilas en z de secciones ópticas 2D que abarcan todo el volumen del grupo de células se muestran individualmente. sometido a un análisis de longitud de correlación de dos puntos, lo que produce datos de tamaño de grupo lineal sobre la base del análisis de n > 1000 puntos en una sola imagen. Este análisis se repite en todas las imágenes de la pila z de la serie temporal grabada originalmente en intervalos de 10 minutos durante varias duraciones totales que van de 10 a 50 h, lo que produce de 60 a 150 puntos de datos consecutivos, especificados para la condición experimental dada. El número de grupos de células (es decir, cultivos celulares individuales en 3D) analizados de esta manera como entidades independientes se representa mediante el número n asignado a la condición experimental específica (tipo de célula, tratamiento) y se incluye en la leyenda del gráfico de la figura correspondiente. Estos gráficos de figuras muestran valores medios +/− error estándar de los valores medios (SEM) calculados a partir de datos de tamaño de grupo promediados de n > 1000 puntos de datos medidos en 6 a 10 planos z para n número de cultivos celulares independientes especificados, y estos se muestran como puntos de datos individuales en series de datos que contienen una serie temporal de 60 a 150 puntos de datos, según el experimento específico. Para obtener más información, consulte los Datos complementarios 2 y los Datos complementarios 4.

En el caso de gráficos donde los datos incluidos no dependen del tiempo, como los datos de la fuerza de separación para dobletes de células (Fig. 1) o los datos del ángulo de contacto para dobletes de células (Fig. 7), los puntos de datos individuales se transformaron en cuadros y Gráficos de bigotes que indican los valores mínimo, cuartil inferior, mediana, cuartil superior y máximo sobre la base del conjunto resumido de estadísticas descriptivas de cinco números. Los números de muestra relevantes se incluyen como el número n de la fuente de datos relevante y, en todos los casos, se indican en las leyendas de las figuras relacionadas. Para obtener más información, consulte los Datos complementarios 1 y los Datos complementarios 5.

Cuando se incluyen datos de tamaño dependientes del tiempo en gráficos de figuras que representan el proceso de agregación multicelular de varios tipos de células, como las Figs. 4 y 8, se utilizó el siguiente método de recopilación y análisis de datos: Se recogieron series de imágenes en intervalos de tiempo de cultivos celulares individuales en 3D a intervalos de 10 minutos durante duraciones que oscilaron entre 10 y 25 h, lo que produjo series de datos sin procesar de 60 a 150 puntos de datos para cada uno. muestra independiente, representada como el número n incluido en la leyenda de la figura correspondiente. Para cada serie de datos, configuramos el muestreo de datos en 1 h que abarca 6 puntos de tiempo y calculamos el valor de tamaño medio +/− error estándar de los valores medios (SEM) y trazamos estos valores en los gráficos relevantes. Para obtener más información, consulte los Datos complementarios 3.

El acceso a los datos de origen numérico para todos los gráficos se proporciona en forma de hojas de datos en los archivos de datos complementarios adjuntos a este artículo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se incluyen en este artículo publicado y en sus archivos de información y datos complementarios.

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Agradecemos a Marton Gulyas (Universidad ELTE Eötvös) por el desarrollo del administrador de experimentos de videomicroscopía y el software de análisis de imágenes. Los autores agradecen a Gabor Forgacs (Universidad de Missouri) por la lectura crítica de versiones anteriores de este manuscrito, así como a Zsuzsa Akos y Andras Czirok (Universidad ELTE Eötvös) por sus fructíferos debates. Este trabajo fue apoyado por el 7PM de la UE, el Proyecto ERC COLLMOT No 227878 para TV, el Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación de Hungría, K119359 y también el Proyecto No 2018-1.2.1-NKP-2018-00005 para LN. Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie nº 955576. MV contó con el apoyo de la beca Ja´nos Bolyai de la Academia de Ciencias de Hungría.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad Eötvös Loránd.

Departamento de Física Biológica, Universidad ELTE Eötvös, Budapest, Hungría

Elod Méhes, Enys Mones & Tamás Vicsek

Departamento de Genética, Universidad ELTE Eötvös, Budapest, Hungría

Máté Varga y Zsigmond Áron

Departamento de Bioquímica, Universidad ELTE Eötvös, Budapest, Hungría

Beáta Biri-Kovács y László Nyitray

Centro de Biotecnología y Biomedicina Marinas, Universidad de California en San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

vanessa barone

Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria, Klosterneuburg, Austria

Vanessa Barone, Gabriel Krens y Carl-Philipp Heisenberg

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EM y TV concibieron el proyecto y diseñaron los experimentos, escribieron el manuscrito; EM realizó los experimentos con el apoyo de MV, AZ y GK para experimentos con pez cebra, BB-K. y LN para manipulaciones genéticas S100A4; VB y E.Méhes realizaron experimentos con DPA; EM realizó análisis de datos con el apoyo de E.Mones para el análisis del tamaño de los conglomerados; C.-PH contribuyó a la interpretación de los datos del estudio. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Tamás Vicsek.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Nicholas Kurniawan y Manuel Breuer. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Méhes, E., Mones, E., Varga, M. et al. La geometría y dinámica de la segregación celular 3D se rigen por la regulación de la tensión superficial del tejido. Común Biol 6, 817 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05181-7

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Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05181-7

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